Гуманизированные антитела и нанотела в современной медицине
Введение
Антитела, или иммуноглобулины – это белковые молекулы, которые вырабатываются активированными В-лимфоцитами при попадании в организм антигенов и специфически реагируют с этими антигенами. Благодаря своей уникальной способности к специфическому связыванию со строго определенными антигенными детерминантами антитела являются ведущим звеном системы гуморального иммунитета.
Однако специфичность связывания антител в то же время является важной предпосылкой для их широкого клинического использования. Первые попытки применения антител в терапевтических целях были предприняты уже в 1891 г, после того, как было продемонстрировано, чтоВведение
сыворотки крови морских свинок, выживших после введения дифтерийного или столбнячного токсинов, при введении другим животным оказывала защитное действие [2].
Уже первые попытки использования антител при лечении дифтерии и ряда других заболеваний продемонстрировали их высокую терапевтическую эффективность. Однако их применение было сопряжено с серьезными побочными реакциями.Введение
пациентам препаратов антител, полученных путем иммунизации животных, приводило к развитию сывороточной болезни, что значительно ограничивало возможности их повторного применения. Первые попытки предупреждения подобных осложнений были направлены на получение антител из сыворотки крови человека, однако источник получения таких антител, а также возможный спектр их антигенной специфичности, весьма ограничен.
Описанная проблема была решена благодаря развитию методов молекулярной и клеточной биологии, в первую очередь, благодаря разработке технологии получения моноклональных антител и их гуманизации. Получаемые таким образом гуманизированные антитела способны к полной реализации своего терапевтического потенциала при значительном снижении вероятности побочных эффектов. Кроме того такие антитела можно получать в достаточно больших количествах in vitro.
Еще одним достижением современной биомедицинской науки стало получение наноантител – уникальных антител упрощенной структуры. Как и для обычных антител, для наноантител характерна высокая специфичность и низкая токсичность, но при этом они имеют ряд потенциальных преимуществ. Эти преимущества делают их весьма перспективным объектом в плане будущего использования для диагностики и лечения заболеваний.
Таким образом, разработка новых направлений использования гуманизированных антител и наноантител в клинической практике в настоящее время имеет чрезвычайно высокую актуальность.
В связи с этим целью настоящей работы является краткий обзор возможностей применения гуманизированных антител и наноантител в современной медицине.
1. Гуманизированные антитела
1.1. Общая схема получения гуманизированных антител
Как уже отмечалось, первым этапом получения гуманизированных антител является выработка моноклональных антител. Эта технология, давшая начало новой эре в создании диагностических и лечебных препаратов, была разработана Кюлером и Милстейном, которые за свои работы были удостоены Нобелевской премии [7].
Необходимо отметить, что подавляющее большинство естественных антигенов, являясь сложными структурами, содержат множество эпитопов, распознаваемых иммунной системой. Поэтому в сыворотке крови иммунизированного животного будут присутствовать антитела против большого числа антигенных детерминант данного антигена. Выделенная фракция этих антител обозначаются как поликлональные антитела. Зачастую они могут даже принадлежать к разным классам иммуноглобулинов.
Моноклональные антитела обладают специфичностью к одному антигену и, как правило, принадлежат к классу IgG. В основе технологии производства моноклональных антител лежит методика получения клеточных гибридом, то есть продуктов слияния двух разных клеток – В-лимфоцита, являющегося продуцентом антител к одному антигену, и клетки миеломы, способной к неограниченному числу делений. При введении гибридом в организм мыши, они дают начало опухоли, продуцирующей моноклональные антитела, которые будут накапливаться в асцитной жидкости. Культуру гибридом также можно поддерживать в условиях in vitro, где они также будут вырабатывать моноклональные антитела (рис. 1).
Однако моноклональные антитела, полученные с помощью гибридомы, будут представлять собой белки, типичные для организма мыши (или другого иммунизированного животного), то есть для организма человека они являются генетически чужеродными и будут вызвать развитие иммунного ответа уже против самих молекул антител. Как уже отмечалось, это становится причиной побочных эффектов, в том числе опасных для жизни пациента [2].
Рис. 1. Общая схема получения моноклональных антител
Для снижения иммуногенности антител первоначально использовались рекомбинантные технологии, которые позволяли получать химерные антитела, имеющие в своем составе фрагменты иммуноглобулинов мыши и человека. Так как специфичность иммуноглобулинов связана с Fab-фрагментом, данный фрагмент брали молекул иммуноглобулинов мыши, а Fс-фрагмент – от иммуноглобулинов человека. Иммуногенность подобных химерных молекул была ниже, однако они также вызывали развитие иммунного ответа [7].
Важнейший шаг в разработке фармпрепаратов на основе моноклональных антител был связан с созданием так называемых гуманизированных моноклональных антител, которые на 90% гомологичны иммуноглобулинам человека. В подобных антителах от молекул исходных моноклональных антител мыши (или другого иммунизированного животного) сохраняется только небольшая часть Fab-фрагментов, так называемые гипервариабельные регионы (рис. 2). Такие антитела сохраняют свою высокую специфичность, но практически не иммуногенны [7].
Рис. 2. Схема организации гуманизированного иммуноглобулина
Гуманизированные антитела содержат 90–95% белка человека и 5–10% белка мыши. Примером гуманизированных антител могут служить такие препараты как алемтузумаб – Кэмпас (антитела к CD52 В- и Т-лимфоцитов, моноцитов и макрофагов); даклизумаб – Зенопакс (антитела к CD25 активированных Т-лимфоцитов); окрелизумаб (антитела к CD20 В-лимфоцитов); трастузумаб – Герцептин (антитела к рецептору эпидермального фактора роста человека 2 типа (HER2) на опухолевых клетках) и др. [1].
Все подходы, используемые для гуманизирования антител, можно условно разделить на рациональные и эмпирические. К группе рациональных методов относят так называемый цикл дизайна, который заключается в получении некоторого числа вариантов антител на основе имеющейся информации об их структуре, из которых выбирают наилучший вариант.
Эмпирические методы гуманизирования антител, напротив, основаны на создании больших комбинаторных библиотек и селекции требуемых вариантов с помощью технологий обогащения или с помощью технологии высокопроизводительного скрининга [6].
В основе наиболее популярного метода получения гуманизированных антител лежит технология отбора нужных последовательностей ДНК методом фагового дисплея. Чужеродные ДНК встраивают в геном бактериофага, после чего кодируемые этой ДНК белки экспрессируются на его поверхности
Зарегистрируйся, чтобы продолжить изучение работы
. После этого проводят отбор бактериофагов, обладающих специфической аффинностью и их клонирование в клетках E. coli. Как правило, требуется 3–6 раундов селекции. Однако для полноценного синтеза гуманизированных антител полученную ДНК необходимо экспрессировать в клетках млекопитающих [2].
1.2. Использование гуманизированных антител в онкологической клинике
Онкология является лидирующей областью по терапевтическому использованию антител. Применение моноклональных антител в настоящее время представляет широко используемую форму пассивной иммунотерапии раковых заболеваний.
В терапии опухолей используют два типа моноклональных гуманизированных антител:
- простые, или неконъюгированные антитела, которые не связаны ни с какими цитотоксическими веществами;
- конъюгированные антитела, лечебный эффект которых обусловлен присоединенными к антителу веществами (цитостатиками, радиоактивными частицами или токсинами) [7].
Механизмы действия антител на раковые клетки-мишени многообразны. К ним относятся иммуноопосредованная (антитело- и комплемент-зависимая) цитотоксичность, стимуляция фагоцитоза опухолевых клеток, блокада рецепторов, активация апоптотических программ опухолевых клеток, а также торможение роста опухоли за счет подавления процессов ангиогенеза [2].
Таким образом, сами по себе антитела способны оказать выраженное ингибиторное действие на рост и развитие опухоли. Поэтому большинство препаратов антител, эффективно применяемых в онкологии, представлены простыми моноклональными антителами.
Кратко рассмотрим механизм действия антител на примере алемтузумаба (Кэмпаса) – препарата для терапии хронического лимфолейкоза. Алемтузумаб представляет препарат гуманизированных моноклональных антител к антигену CD52, который экспрессируется на мембране большинства зрелых нормальных и опухолевых Т- и В-лимфоцитов с очень высокой плотностью (около 500000 молекул на клетку). В результате молекулы антигена CD52 покрывают около 5% всей клеточной поверхности лимфоцитов у пациентов с данным заболеванием. Это определяет чрезвычайно высокую активность алемтузумаба в отношении хронического лимфолейкоза и Т-клеточных лимфом [10].
В молекуле алемтузумаба только незначительные по размеру участки, которые непосредственно связываются с антигеном, имеют крысиное происхождение, а вся остальная часть молекулы представляет фрагмент иммуноглобулина человека. Эти антитела были разработаны в Англии и в 2001 г. одобрены в качестве препарата для лечения хронического лимфолейкоза. В России препарат продается под названием Кэмпас.
Вариабельный регион алемтузумаба связывается с антигеном CD52 на поверхности лимфоцитов, а константный регион — с Fc-рецепторами на поверхности цитотоксических клеток, которые уничтожают мишень. Таким образом реализуются механизмы антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности. Помимо этого алемтузумаб активирует систему комплемента, что приводит к образованию комплекса, разрушающего мембрану раковой клетки. Таким образом, задействуются также механизмы комплемент-зависимой цитотоксичности. Эти два механизма, а также способность индуцировать апоптоз опухолевых клеток составляют основу действия данного препарата антител [10].
Кэмпас используют в основном для лечения больных хроническим лимфолейкозом, не реагирующих на традиционную химиотерапию (флударабином), а также как препарат первой линии в терапии пациентов, которые имеют неблагоприятный прогноз заболевания, связанный с генетическими нарушениями, например делецией гена р53 [4].
Препарат трастузумаб (Герцептин), разработанный компанией стал первым препаратом гуманизированных антител, зарегистрированным для лечения солидных опухолей (1998 г.).
Трастузумаб представляет рекомбинантные гуманизированные моноклональные антитела против одного из видов рецепторов эпидермального фактора роста (HER2/neu). Гиперэкспрессия HER2/neu-рецепторов в клетках рака молочной железы выявляется у 20–30% больных и сопровождается резко сниженными темпами апоптоза, усилением пролиферации, уменьшением числа эстрогеновых рецепторов в опухоли, снижением эффективности химио- и эндокринотерапии. Герцептин блокирует пролиферацию, вызывает апоптоз клеток-мишеней и обладает антиангиогенной активностью. Препарат разрешен к применению в монотерапии больных с экспрессией HER2/neu в сочетании с метастатическим раком молочной железы, а также в комбинации с цитостатическими агентами у больных, которые ранее не получали химиотерапию [9].
Бевацизумаб (Авастин) – это рекомбинантные гуманизированные моноклональные антитела, которые избирательно связываются с биологически активным эндотелиальным сосудистым фактором роста (VEGF) и нейтрализуют его, что приводит к снижению васкуляризации и угнетению роста опухоли. Авастин обладает выраженным цитостатическим и цитотоксическим эффектом, приводя к регресси многих солидных опухолей, замедлении опухолевого роста или увеличении времени до прогрессии. Данные препарат был зарегистрирован в США в 2004 г. в качестве первой линии в терапии метастатического колоректального рака (в комбинации с 5-фторурацилом). В России препарат продается под маркой Авастин [10].
Кроме названных препаратов в онкологической клинике сегодня используется большое число простых моноклональных антител, которые невозможно рассмотреть в рамках одной работы. Многие из них зарегистрированы в России.
Конъюгированные моноклональные гуманизированные антитела в онкологии сегодня используются реже. Так, в настоящее время в мире для терапии опухолей зарегистрировано только два моноклональных антитела, соединенных с радиоактивными частицами:
- ибритумомаб тиуксетан (Зевалин), моноклональные антитела против CD20, соединенные с иттрием-90, зарегистрированы для лечения рецидивов и рефрактерных форм фолликулярных лимфом;
- тозитумомаб (Бексар), моноклональные антитела к антигену CD20, конъюгированные с радиоактивным изотопом йода-131, получили одобрение FDA для лечения рецидивов фолликулярных лимфом [10].
Еще одна группа конъюгированных антител, использующихся для лечения онкологических заболеваний, представлена иммунотоксинами, которые получают путем присоединения к антителам бактериальных (дифтерийный токсин или экзотоксин синегнойной палочки) или растительных токсинов (рицин А или сапорин). Результаты первых клинических испытаний иммунотоксинов показали перспективность подобных препаратов [10].
Однако ограниченный опыт клинического применения иммунотоксинов свидетельствовал не только о положительном эффекте применения этих конъюгатов, но и об опасности развития осложнений, связанных их токсическим действием. В 2000 г. в США был зарегистрирован единственный препарат иммунотоксина – гемтузумаб озогамицин (Милотарг), предназначенный для лечения острого миелобластного лейкоза у лиц старше 60 лет. Милотарг – это препарат гуманизированных антител к CD33, который экспрессирован на большинстве лейкемических клеток, конъюгированных с токсином калихимицином
50% реферата недоступно для прочтения
Закажи написание реферата по выбранной теме всего за пару кликов. Персональная работа в кратчайшее
время!
Задать вопрос
на новый заказ в Автор24. Это бесплатно.
