Метод изоэлектрического фокусирования в фармацевтическом анализе

Изоэлектрическое фокусирование – метод разделения амфотерных веществ с большой молекулярной массой, например, белковой природы на структурные единицы (пептиды) при создании необходимой рН среды [10].
Как трактует англо-русский словарь генетических терминов, «Метод основан на миграции макромолекул в градиенте рН под действием электрического поля в область значений рН, соответствующих изоэлектрическим точкам каждой из макромолекул» [2]. Для амфолитов характерны индивидуальные значения изоэлектрической точки.
Изоэлектрическая точка (pI) - это такое значение рН растворов амфотерных веществ, при котором они полностью диссоциировали на биполярные ионы с суммарным зарядом, равным нулю. При воздействии постоянного электрического тока ионы мигрируют в растворе.
Если рН раствора белка меньше его изоэлектрической точки, то молекулы, имея положительный заряд, под действием электрического тока движутся к катоду. Если возник или искусственно создан градиент рН, увеличивающийся от анода к катоду, то катион белковой молекулы будет стремиться к изоэлектрической точке, при этом заряд становится нулевым.
Принципиальная схема изоэлектрического фокусирования представлена на рисунке 1.
Рис.1 – Принципиальная схема изоэлектрического фокусирования
Компоненты смеси в зависимости от характерной изоэлектрической точки рI разделяются в градиенте рН

. В изоэлектрической точке частица не имеет заряда, она нейтральна.
Градиент рН можно создать прибавлением в раствор буферов. Исследуемый образец вносится в колонку в отдельную зону или смешивается по всему объёму. При действии электрического поля на амфолиты возникает градиент рН. Частицы заряжаются и перемещаются к противоположно заряженному электроду. При уравнивании значений рI и рН движение ионов прекращается, и образуются узкие зоны.
Следует принимать во внимание, что изоэлектрическое фокусирование с амфолитами можно проводить при величине разности рН не более 1,5-2,0, т.к. при увеличении градиента происходит денатурирование белков [9].
Метод изоэлектрического фокусирования зародился в 60-х годах ХХ столетия. Свой практический вклад в развитие метода внёс Свенсен, который сумел разделить гемоглобин человека на компоненты, искусственно создавая градиент рН буферным боратным раствором [8]. В современной медицинской практике этот метод всё больше распространяется для диагностики и лечения серьёзных генных заболеваний. Описание метода включено в ГФ РФ XIV издания, - ОФС.1.7.2.0021.15 «Изоэлектрическое фокусирование».
Для искусственного создания градиента рН используются амфолиты, - смеси синтетических полиаминополикарбоновых кислот в диапазоне изоэлектрических точек (рI) от 3,0 до 10,0 единиц рН (рис.2)