Жидкостная колоночная хроматография, типы сорбентов, метод ВЖХ

Введение модифицирующих добавок проводят с целью уменьшить влияние нежелательных механизмов адсорбции или создать ее определенный механизм [5,8].
Вопрос оптимизации состава подвижной фазы – одна из самых тяжелых и еще не решенных проблем жидкостной хроматографии. Как общий критерий необходимо учитывать, что объемы удержания должны быть устойчивыми к незначительным изменениям состава подвижной фазы, в противном случае это приводит к невоспроизводимости условий хроматографирования.
Состав подвижной фазы, может либо оставаться неизменным в течение всего анализа (изокритическое элюирование), или изменяться по заданной программе (градиентное элюирование). Градиентное элюирование позволяет значительно сократить общее время анализа за счет сокращения времени выхода соединений, которые сильно удерживают колонкой; улучшить разделение всей смеси; улучшить форму пика и уменьшить "хвост"; вследствие небольшого различия в форме пиков увеличивает чувствительность ряда компонентов смеси, которые выходят из колонки позже др. [5,10].
3.3 Неподвижная фаза
В высокоэффективной жидкостной хроматографии используется большое количество типов неподвижных фаз:
силикагель, оксид алюминия или пористый графит, используемый в нормально-фазовой хроматографии, в которой разделение основано на разнице в адсорбции и/или массовом распределении (распределительная хроматография);
большое количество химически модифицированных носителей, изготовленных из полимеров, силикагеля или пористого графита, используемых в нормально-фазовой (адсорбционная хроматография) и обращенно-фазовой хроматографии, в которой разделение основано на разделении молекул между подвижной и неподвижной фазой;
смолы или полимеры, модифицированные кислотными или основными группами, используемые в ионообменной хроматографии, в которой разделение основано на конкурирующем взаимодействии между разделяемыми ионами и ионами подвижной фазы;
пористый силикагель или полимеры, используемые в эксклюзионной хроматографии, в которой разделение основано на разнице в размерах молекул, соответствующих стерической эксклюзии;
специальные химически модифицированные неподвижные фазы, например, производными целлюлозы или амилозы, белками и пептидами, циклодекстринами и т.д., используемые для разделения энантиомеров (хроматография на хиральных неподвижных фазах);
другие неподвижные фазы, используемые в высокоэффективных модификациях различных типов жидкостной хроматографии [12,14].
Большая часть разделений основана на механизме распределения между химически модифицированным силикагелем, использующимся в качестве неподвижной фазы, и полярными растворителями, использующимися в качестве подвижной фазы. Поверхность носителя, например, силанольные группы силикагеля, реагирует с различными силановыми реагентами с образованием ковалентно связанных силильных производных, покрывающих различное число активных групп на поверхности носителя. Природа привитой фазы является важной характеристикой, определяющей разделяющие свойства хроматографической системы. Ниже представлены наиболее часто используемые привитые фазы:
Октильная – Si-[CH2]7-CH3 C8
Октадецильная – Si-[CH2]17-CH3 С18
Фенильная – Si-[CH2]n-C6H5 C6H5
Цианопропильная – Si-[CH2]3-CN CN
Аминопропильная – Si-[CH2]3-NH2 NH2
Диольная – Si-[CH2]3-O-CH(OH)-CH2-OH
При отсутствии других указаний производителя, находящаяся в колонках обращенно-фазовая неподвижная фаза на основе силикагеля считается стабильной в подвижных фазах при значениях рН в диапазоне от 2,0 до 8,0. Колонки, содержащие пористый графит или частицы полимерных материалов, например, сополимера стирола с дивинилбензолом, стабильны в более широком диапазоне значений рН [4,8].
Так как ассортимент колонок, который есть в продаже для ВЭЖХ, очень большой, то становится все труднее найти две колонки с совершенно одинаковыми свойствами. Ситуация осложняется тем, что каждый производитель делает рекламу своих колонок, подбирая условия и вещества для анализа таким образом, чтобы показать только положительные характеристики колонки, а не сравнивать ее с теми, что уже используются.
В качестве сорбентов в ВЭЖХ применяют материалы на основе силикагеля, очень редко - на основе алюминия окиси. В последнее время появились полимерные сорбенты. Наиболее распространенные колонки, заполненные силикагелем с привитыми октадецилсилильными (С18) или октилсилильными (С8) группами. Прямофазные колонки на основе чистого силикагеля используют редко. Это связано с тем, что лекарственные средства, как правило, достаточно полярные вещества, более подвижные на привитых (алкилированных) сорбентах. Другой важной причиной является то, что использование прямофазных сорбентов (силикагеля) требует применения подвижных фаз, в состав которых входят органические растворители (этилацетат, ацетон, хлороформ и т. д.), которые интенсивно поглощают в ультрафиолете, что затрудняет применение спектрофотометрических детекторов [9,11].
В привитых сорбентах более 50% поверхности остается незакрытой, поэтому при анализе очень полярных соединений эти сорбенты проявляют прямофазные свойства. В таком случае значительные элюирующие свойства проявляет вода, неактивная в случае малополярних веществ.
Тип привитого сорбента определяется условиями поставленной задачи и связывается с подвижной фазой

. В некоторых случаях вместо сорбентов с привитыми С18-группами применяют более полярные сорбенты с привитыми С8, С 3, а также CN-группами.
При проведении хроматографического анализа с использованием ион-парных реагентов (алкилсульфонаты, а также симметричные или асимметричные четвертичные соли аммония) часто становится проблема полноты отмывания сорбента от модифицирующего агента подвижной фазы (оборотное взаимодействие). Так, например, при использовании додецилсульфата натрия, последний сильно адсорбируется на поверхности силикагеля, что, в конечном итоге, влияет на хроматографические свойства сорбентов. Эта модификация может привести к невоспроизводимости хроматограмм на новой колонке [5,8].
Еще одним фактором, который влияет на хроматографические свойства сорбентов, является проведение предварительной химической модификации исследуемых веществ перед их хроматографированием (например, определение компонентного состава гентамицина сульфата после взаимодействия с тиогликолевою кислотой или определения аминокислот через их динитробензольные производные). При хроматографировании таких проб поверхность силикагеля в значительной степени подвержена влиянию модифицирующих реагентов (в нашем случае тиогликолевой кислоты или динитрофторбензола). При этом свойства поверхности за счет необратимого химического взаимодействия изменяются в значительной степени, так, что проведение другого, более простого анализа невозможно [10].
Сорбенты одного и того же типа производства различных фирм несколько отличаются по хроматографическому поведению, что связано с разной степенью покрытия поверхности привитыми группами и разной удельной поверхностью подложки. Поэтому при анализе лекарственного средства желательно ориентироваться на колонки какой-то одной фирмы или в тексте монографии должна быть предусмотрена процедура оптимизации условий анализа [12].
3.4 Детекторы
Как детекторы в жидкостной хроматографии обычно используют спектрофотометрический детектор с переменной (190-900 нм) или фиксированной (чаще всего при 240 нм) длиной волны, рефрактометрический или флуорометрический детекторы. Могут быть использованы и другие детекторы, например, изонизационно-пламенный, электрохимические, масс-спектрометрический и т.д.
При проведении тестов "Контроль специфических (именно указанных) примесей" и "Количественное определение", при прочих равных условиях, целесообразно применять спектрофотометрический детектор с как можно более специфической длиной волны детектирования, чтобы свести к минимуму воздействие на анализ посторонних веществ. Для этого длину волны целесообразно выбирать в максимуме поглощения соединения, исследуется [13,14].
При проведении тестов на хроматографическую чистоту ("Обычные примеси", "Хроматографическая чистота", "Родственные соединения" и т. д.) целесообразно выбирать как можно менее специфическую длину волны детектирования (190-220 нм), при которой интенсивность поглощения различных соединений выравнивается. При этом возрастают требования к чистоте (пропуск) подвижной фазы. При разработке методики анализа проверяют устойчивость к изменению аналитической длины волны детектирования – при отклонении на 2-4 нм результаты не должны сильно изменяться. Полученные таким образом величины (внутренняя нормализация) имеют относительный характер (из-за различий коэффициентов поглощения исследуемых соединений). В целом, чем меньше длина волны детектирования, тем более объективные тесты, характеризующие хроматографическую чистоту.
Недостаток спектофотометрического детектора – его недостаточная универсальность: многие вещества (сахара, спирты, алифатические амины и т. д.) Плохо поглощают даже в дальнем ультрафиолете. В этом случае целесообразно использовать универсальный детектор - рефрактометрический. Однако, чувствительность его на несколько порядков хуже спектрофотометрического, что очень ограничивает его использование [13,15].
4. Критерии, характеризующие хроматографический процесс
К ним относятся следующие критерии:
удержание;
эффективность;
степень разделения.
Их определяют по хроматограмме. Основной характеристикой вещества является объем удержания, который для i-того компонента рассчитывают по уравнению:
VRi = F · ti = Vm + Ki · Vs,
где Vm = F · tm – мертвый объем колонки, или объем удержания компонента, который не сорбируется;
F – объемная скорость подвижной фазы;
tm – время содержание компонента, не сорбируется;
ti – время содержание i-того компонента;
Ки – константа распределения, равной отношению концентрации i-того компонента в неподвижной и подвижной фазах;
Vs – объем неподвижной фазы.
Более объективной величиной является исправленный объем удержания:
VNi = VRi - Vm = Ki · Vs.
Для идентификации веществ пользуются относительным объемом удержания ri:
ri =,VRi-VmVRст-Vmti-tmtст-tm
где VRст и tст – объем и время удержания стандартного вещества.
Для проверки достоверности результатов анализа используют такие показатели, как коэффициент симметрии пика, коэффициент разделения, число теоретических тарелок, коэффициент емкости компонента и отношение сигнал / шум [10,12].
Одной из характеристик хроматограммы является форма пика. Она зависит от нагрузки и условий хроматографирования (выбора неподвижной фазы, состав и скорости движения подвижной фазы)