Транскриптомика и протеомика плазмы крови.

Введение

Во второй половине 20-го века было сделано множество важнейших открытий в биологии. Была определена структура ДНК, успехи кристаллографии привели к тому, что ученые научились определять структуру белка с точностью до нескольких ангстрем. Сегодня биология является одной из наиболее быстро развивающихся сфер науки.
Плазма крови содержит огромное количество различных белков и выполняет ряд важнейших функций в организме. Сегодня ученые и врачи понимают, что общий подход к лечению заболеваний не дает такого эффекта, как индивидуальный подход к каждому пациенту. Современные подходы исследования белков плазмы крови, такие как протеомика и трансриптомика, помогают понять, что происходит с сигнальными путями и даже отдельными белками в норме и при патологии. В данной работе рассмотрены методы, используемые в протеомике и транскриптомики плазмы крови и перспективы, открывающиеся в будущем для персонализированной медицины.
1. Белки плазмы крови и их функции.
Плазма, также известная как плазма крови, имеет светло-желтоватый или соломенный цвет. Она служит жидкой основой для крови. Кровь без эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов – это плазма. Сыворотка, иногда фибриногена. Плазма содержит от 91 до 92% воды и от 8 до 9% твердых веществ. В плазме содержатся:
коагулянты, в основном фибриноген, помогающие крови свертываться,
белки плазмы, такие как альбумин и глобулин, которые помогают поддерживать коллоидное осмотическое давление на уровне около 25 мм.рт.ст.,
электролиты, такие как натрий, калий, бикарбонат, хлорид и кальций, поддерживающие рН крови,
иммуноглобулины, которые помогают бороться с инфекциями,
небольшое количество других ферментов, гормонов и витаминов.
Саму плазму, которая составляет 55% от общей крови не производит ни один из органов. Она формируется из воды и солей, поглощенных из пищеварительного тракта. Плазменные белки, с другой стороны, производятся различными органами, причем это зависит от стадии развития человека.
На эмбриональной стадии за выработку отвечают мезенхимные клетки. Первым синтезируемым белком является альбумин, за которым следует глобулин и другие белки плазмы.
У взрослых за синтез белков плазмы отвечают ретикулоэндотелиальные клетки печени. Костный мозг вместе с селезенкой, деградирующие клетки крови и клетки тканей организма, также способствуют образованию белков плазмы. Гамма-глобулины происходят из B-лимфоцитов, которые, в свою очередь, образуют иммуноглобулины.
Функции плазмы крови.
Поскольку плазма образует жидкую основу крови, функции, выполняемые плазмой и кровью, перекрываются. Её функции:
Коагуляция. Фибриноген играет важную роль в свертывании крови наряду с другими прокоагулянтами.
Защита: иммуноглобулины и антитела в плазме играют важную роль в защите организма от бактерий, вирусов, грибков и паразитов.
Поддержание осмотического давления: Коллоидное осмотическое давление поддерживается на уровне около 25 мм.рт.ст. белками плазмы, такими как альбумин.
Питание: транспортировка питательных веществ, таких как глюкоза, аминокислоты, липиды и витамины, всасываемых из пищеварительного тракта, в различные части тела в качестве источника топлива, для роста и развития.
Дыхание: транспортировка дыхательных газов, то есть перенос кислорода к различным органам и углекислого газа обратно в легкие для выведения.
Выведение: кровь удаляет азотистые отходы, образующиеся после клеточного метаболизма, и транспортирует их в почки, легкие и кожу для последующего удаления из организма.
Гормоны: гормоны попадают в кровь и транспортируются к ее целевым органам.
Регуляция кислотно-щелочного баланса. Белки плазмы способствуют кислотно-щелочному балансу благодаря их буферному действию.
Регулирование температуры тела: посредством поддержания баланса между потерей и сохранением тепла [1].
Поддержание кислотно-основного баланса.
Плазма крови и межклеточное пространство имеют рН 7,4, то есть концентрация ионов Н+ приблизительно равна 40∙10-9М, причем она поддерживается на постоянном значение, а большие изменения приводят к летальному исходу.
В поддержания постоянства рН участвуют буферные системы плазмы крови, наиболее важным из которых является бикарбонатный буфер. Равновесие значения рН поддерживается за счет постоянного производства и удаления протонов. Организм получает протоны из пищи – из свободных кислот (лимонной, фосфорной и др.) и серосодержащих аминокислот. Наибольший вклад вносят метионин и цистеин, образующиеся при расщеплении белков. В печени атомы серы этих аминокислот окисляются до серной кислоты, которая диссоциирует на сульфат-ион и протоны.
При анаэробном гликолизе в мышцах и эритроцитах глюкоза превращается в молочную кислоту, диссоциация которой приводит к образованию лактата и протонов. Образование кетоновых тел — ацетоуксусной и 3-гидроксимасляной кислот — в печени также приводит к освобождению протонов, избыток кетоновых тел (при голодании, сахарном диабете) ведет к перегрузке буферной системы плазмы и снижению рН (метаболический ацидоз; молочная кислота → лактацидоз, кетоновые тела → кетоацидоз). В нормальных условиях эти кислоты обычно метаболизируют до СО2 и Н2О и не влияют на баланс протонов.
Удаление протонов происходит вместе с мочой, они пападают в нее за счет активного обмена ионами натрия. При этом в моче протоны забуфериваются, взаимодействуя с NH3 и фосфатом.
Как уже было сказано выше, наиболее одной из самых важных буферных систем плазмы крови является бикарбонатный буфер, состоящий из слабой угольной кислоты (рК1 6,1) и ее кислого аниона бикарбоната. Угольная кислота Н2СО3 находится в равновесии со своим ангидридом СО2. При нормальном рН плазмы крови концентрации НСО3- и СО2 находятся в соотношении 20:1. Растворенный в крови СО2 равновесно обменивается с СО2 газовой фазы альвеол легких. Поэтому НСО3-/СО2 - является эффективной открытой буферной системой. Ускоренное или замедленное дыхание изменяет концентрацию СО2, что приводит к изменению рН плазмы. Таким образом, легкие могут быстро и действенно влиять на рН плазмы без участия систем удаления протонов [2].

Рисунок 1 – Схема кислотно-основного баланса [2].


Рисунок 2 – Буферные системы плазмы [2].


2. Протеомика белков плазмы крови
Совокупность всех белков организма называется «протеом». Наука изучающая белки, их свойства и структуру носит название «протеомика». Она занимается идентификацией белковых молекул, определяет количественный состав образцов, таких как плазма крови, спинномозговая жидкость и др. В основном это используется в медицине, при наблюдениях пациента на разных стадиях заболевания, для понимания эффективности терапии.
Технологический арсенал протеомики
Для разделения белков по массе стандартно используют электрофорез в полиакриламидном геле.
Для их дальнейшей идентификации применяют большое количество разных методов, основными из которых можно выделить:
•микросеквенирование белков;
•жидкостную хроматографию (HPLC);
•методы иммунохимического тестирования с использованием моноклональных антител;
• масс-спектрометрию.
Протеомика плазмы крови
Протеомика часто применяется для анализа белкового состава плазмы крови, так как он содержит около десятой части всех белков организмы

. При этом больше половины таких белков сосуществует в виде больших мультипротеиновых комплексов. И современные технологии позволяют их выделить и изолировать для дальнейшего изучения.
На сегодняшний день идентифицировано огромное количество белков, их число уже превысило 10000, при чем около 900 белковых молекул идентифицированы с точностью выше 95%.
Протеомный анализ плазмы крови открывает большие возможности для исследователей и терапевтов. Но существует также ряд недостатков данного методы, среди которых широкий разброс концентраций белков, при том, что ценные для диагностики белки имеют низкую концентрацию, что усложняет процессы изоляции и детекции.
Учитываю широкое применение данного метода в исследовательских проектах, стоит отметить, что его использование в клинической практике не так популярно. По большей части это связано с недостаточным развитием инфраструктуры и сложностью анализа данных, так как на данный момент скорость накопления данных сильно превысила скорость их обработки и унификации [3].
Проект "Протеом Плазмы Крови"
Проблемы с быстро растущим количеством данных о белках плазмы крови, их разобщенность, привели к созданию в 2003 году проекта «Протеом человека», целью которого стало объединение результатов работы многих лабораторий, в том числе российских. Сегодня проект продолжает свою работу, а одним из его достижений стал Пептидный Атлас человека.
Фаза I, завершенная в 2005 году, включала сбор результатов протеомики плазмы из 18 лабораторий и позволила составить список из 3020 идентифицированных белков, идентифицированных с двумя или более пептидами, независимо от лаборатории или образца. Позднее в том же году одна из групп ученых применила строгий статистический подход к тем же данным, что позволило получить сокращенный набор из 889 белков с уверенностью в идентификации белка не менее 95%. В том же году был сконструирован первый Пептидный Атлас плазмы человека из 28 наборов данных. Последняя сборка Пептидного атласа содержала более 3000 различных белков.
Для анализа ученые применяли геноцентрический подход, его особенностью является то, что проанализированный белок наносится на карту в соответствии с геном, который его кодирует. Также возможна комбинация данного метода с направленным масс-спектрометрическим анализом белка, который включает два этапа: создание эталонной библиотеки и непосредственный анализ проб (рис. 3).
Помимо определения всех белков плазмы крови, важным этапом стал сбор данных о различных модификациях идентифицированных белков. Так как помимо того, что каждый ген может кодировать огромное количество белков за счет альтернативного сплайсинга, белки также проходят ряд посттрансляционных модификаций.
Основным результатом работы данного проекта стало определение всех белков плазмы крови здорового человека, с определением количества каждого из них. Результаты могут быть использованы для создания диагностических систем, что позволит диагностировать ранние стадии развития заболеваний [4].

Рисунок 3 – Схема проведения масс-спектрометрического анализа [4].


3. Методы протеомики и транскриптомики
Электрофорез в полиакриламидном геле
Как говорилось выше для разделения белков используют электрофорез в полиакриламидном геле.
Гель-электрофорез можно использовать для определения:
чистоты образца белка;
гетерогенности и степени деградации белка;
субъединичного состава образца белка.
Основополагающим принципом электрофореза является свойство миграции заряженных частиц в электрическом поле. Таким образом, это простое движение противоположных зарядов. Электрическое поле создается на электродах источника питания, и заряженные ионы движутся в этом электрическом поле (рис. 4).

Рисунок 4 – Анод и катод [5].

Факторы, влияющие на скорость миграции электрофореза (Rf):
Напряженность электрического поля, Е (прямо пропорциональна скорости миграции);

Заряд на ионных частицах, q (прямо пропорционален скорости миграции);
Коэффициент трения поддерживающей матрицы, f (обратно пропорционален скорости миграции).
Таким образом, Rf α qE / f
Эти факторы могут варьироваться следующим образом:
Напряженность поля зависит от напряжения источника питания. Таким образом, мы можем изменять напряжение напрямую.
Заряд на ионной молекуле является функцией pI молекулы и pH раствора
Если pI> pH, молекула катионная (мигрирует к катоду);
Если pI <pH, молекула является анионной (мигрирует к аноду);
Если pI = pH, молекула нейтральна (нет миграции в электрическом поле).
Поэтому мы можем изменить скорость миграции (и, возможно, направление миграции), изменив рН раствора.
В гель-электрофорезе белков почти исключительно используется полиакриламид. Это полимер, состоящий из двух ковалентно связанных компонентов: акриламида и бис-акриламида.
Бис-акриламид является по существу сшивающим компонентом акриламидного полимера, при этом общая концентрация акриламида в геле влияет на миграцию белков через матрицу (т.е. определяет коэффициент трения). Белки с высокой молекулярной массой разделяются с использованием низкого коэффициента трения (то есть низких концентраций) полиакриламида, а белки с низкой молекулярной массой отделяются с использованием высокого коэффициента трения (т.е. высокой концентрации полиакриламида [5].
Масс-спектрометрия.
Масс-спектрометрия - это мощный аналитический метод, используемый для количественной оценки известных материалов, выявления неизвестных соединений в пробе и выяснения структуры и химических свойств различных молекул. Полный процесс включает преобразование образца в газообразные ионы с фрагментацией или без нее, которые затем характеризуются отношением массы к заряду (m/z) и относительными содержаниями.
Основной принцип.
Масс-спектрометр генерирует несколько ионов из исследуемого образца, затем разделяет их в соответствии с их удельным отношением массы к заряду (m/z), а затем регистрирует относительное содержание каждого типа ионов.
Первым этапом масс-спектрометрического анализа соединений является получение газофазных ионов соединения, в основном путем электронной ионизации. Этот молекулярный ион подвергается фрагментации. Каждый первичный продукт-ион, полученный из молекулярного иона, в свою очередь подвергается фрагментации и так далее. Ионы разделяются в масс-спектрометре в соответствии с их отношением массы к заряду и определяются пропорционально их содержанию