Спектральные характеристики аминокислот, белков, нуклеиновых ксилот

Введение

Спектрофотометрия – метод определения качественного и количественного состава веществ, основанный на определении спектра поглощения при четко определенной длине волны. Длина волны определяется по максимуму кривой поглощения вещества, которое исследуется.
К спектрофотометрическим методам относятся такие типы исследований:
1. Эмиссионный спектральный анализ. В основе данного метода лежит исследование эмиссионных спектров составляющих элементов вещества. Используя метод, возможно установить элементарный состав соединения
2. Абсорбционная спектроскопия. Данный вид спектроскопии основан на получении спектров поглощения изучаемого вещества. Можно работать в ультрафиолетовой, видимой и инфракрасной областях спектра.
3. Использование данных спектров комбинированного рассеяния света.


Биополимеры и спектрофотомерия
В биохимических исследованиях часто прибегают к методам спектроскопии, при этом проводят оценку спектральных характеристик аминокислот, белков, нуклеиновых кислот. Одной из особенностей работы данного метода с биополимерами, к которым относят белки и нуклеиновые кислоты, является то, что исследователи не могут работать в газовой фазе они вынуждены работать с растворами, а исследования спектров в данной фазе сложны по причине появления дихроичных эффектов.
Установлено, что практически со всеми белками и нуклеиновыми кислотами можно работать, используя в качестве растворителей водные буферные растворы, рН которых больше 7,0, и эти растворы должны содержать необходимые количества электролитов, в качестве последнего часто используется раствор NaCl концентрацией 0,15 М, если же использовать чистую воду как растворитель, то спектральные измерения ограничиваются областью, где λ > 170 нм. При более низких значениях длин волн поглощение даже очень тонких пленок воды очень значительно, перекрывает вклад макромолекул. Так как полярность воды велика, то электронные полосы поглощения намного шире, чем у большинства других растворителей.
Для белков и нуклеиновых кислот характерен узкий температурный интервал, где они пребывают в нативном состоянии, да вода существует в жидком состоянии только в интервале температур от 0 до 1000С. Это усложняет работу исследователя так, как со многими модельными соединениями невозможно работать в этом температурном интервале.
Изучить спектральные характеристики - значит найти возможность найти максимально характерную для анализа раствора - область спектра, используя при этом соответствующий светофильтр. Аналитические определения не требуют определять все спектральные характеристики исследуемых растворов аминокислот, довольно точно определить коэффициенты пропускания и вырисовать спектр поглощение при тех длинах волн, когда поглощение является максимальным. Под коэффициентом пропускания понимают безразмерную физическую величину, которая определяется как отношение потока излучения, которое прошло через среду, к потоку излучения, которое падает на неё.
Под спектром поглощения понимают спектр, где отсутствуют или максимально ослаблены некоторые спектральные участки, которые соответствуют тем длинам волн, которые поглощаются исследуемым веществом. Такой спектр называется спектром поглощения.


Хромофоры
Хромофорами называют функциональные группы, которые способны к поглощению электромагнитного излучения без оглядки на окраску раствора. Например, карбонильная группа C=O работает как хромофор, который поглощает в области длины волны 280 нм.
В таблице 1 представлены хромофоров, которые встречаются в молекулах аминокислот, белков и нуклеиновых кислотах. Присутствие в молекулах указанных биополимеров хромофорных групп позволяет использовать ультрафиолетовую и видимую спектроскопию для изучения.
Таблица 1.
Типичные хромофоры и их характеристики
Хромофор Длина волны, нм
Возбуждение электронов Коэффициент молярной экстинкции (мах) и интенсивность полосы поглощения
175
185 14 000 сильная
8 000 сильная
184
200
255 -*

n-* 60 000 сильная
4 400 средняя
204 слабая
185 Свободной электронной пары кислорода Полоса средней силы
215 Свободной электронной пары азота Полоса средней силы
340-370 Свободных эл. пар азота Слабая полоса

Итак, хромофоры – группировки атомов, которые содержат электроны, а также свободные электронные пары гетероатомов, которые способны образовывать характерные линии поглощения в УФ-области спектра.
Выделяют три класса среди хромофоров белков:
Хромофор – пептидная группа
Хромофор - боковые группы аминокислотных остатков
Хромофор - простетическая группа.
Использование формамида или N -метил ацетамида позволяет расширить возмоность спекртоскопии для исследования свойств пептидных хромофоров. Эти соединения относят к м
В теории хроматофоров выделяют ауксохромы, под которыми понимают такие функциональные группы, которые способны взаимодействовать с хромофором, используя неподеленные электроны, и эти электроны вместе с электронами хромофора образовывают новый, более мощный хромофор. К таким группам можно отнести такие группы как, –ОН, –ОR, –NH2.
Установлено, что полоса может сдвигаться в разные области спектра как в длинноволновую, так и в коротковолновую, в зависимости от окружающих групп хромофора, также и природа растворителя влияет на интенсивность полосы. В соответствии с номенклатурой сдвигов различают:
1.Батохромный сдвиг – сдвиг в сторону длинных волн.
2.Гипсохромный сдвиг– в сторону коротких волн;
3.Гиперхромный эффект – увеличение интенсивности поглощения;


Спектральная характеристика аминокислотных остатков
Для радикалов таких аминокислот, как Asp, Glu, Asn, Gln, Arg и His, характерны такие электронные переходы, полосы которых сложно рассмотреть по причине сильного поглощением пептидной группы

. Поэтому зарегистрировать эти переходы в белках или полипептидах очень сложно. На это влияет два фактора:
Интенсивность n à p*-переходу пептидной группы,
Число соответствующих боковых радикалов как правило меньше, чем число пептидных групп в молекуле белка.
Анализируя выше сказанное, отмети что в качестве хромофоров белковых молекул могут выступать только те, которые фиксируется при λ >230 нм, в этой области вклад в общее поглощение пептидных групп очень незначителен. Под эту характеристику попадают ароматические аминокислоты такие как Phe, Туг и Тгр, гистидиновый фрагмент His, дисульфидный мостик аминокислоты цистин. Спектры поглощения этих трех ароматических аминокислот представлены на рисунке 2.
-508041148000

Рис.2 Спектр ароматических кислот
Как видно оптическая плотность раствора триптофана намного выше, чем двух других аминокислот, но он нечасто встречается в белках в значительных количествах, в связи с этим вклад тирозина в поглощение белка часто оказывается значимым.
 Оптическая плотность раствора фенилаланина характеризуется самыми низкими значениями среди всех трех аминокислот. По этой причине установить наличие этой кислоты в белках, которые содержат и другие ароматические аминокислоты, оптическими методами очень трудно. Для фенилаланина при λ= 250 нм имеется запрещенный по симметрии p à p*-переходом, аналогичная природа полосы при λ = 256 нм в бензоле. В тирозине локальная симметрия оказывается значительно ниже, а наблюдаемый при λ = 274 нм переход – интенсивнее.
Максимумы поглощения и молярные коэффициенты погашения аминокислот, встречающихся в белка при рН = 7 седены в таблице 2.
Таблица 2
Максимумы поглощения и молярные коэффициенты погашения некоторых аминокислот
Соединение макс, нм
при макс (х10-3)
Триптофан 280 5,6

219 47,0
Тирозин 274 1,4

222 8,0

193 48,0
Фенилаланин
257 0,2

206 9,3

188 60
Гистидин 211 5,9
Цистеин 250 0,3
Спектральные характеристики белков
Остановимся на свойствах пептидной связи. Известно, что электроны пептидной группы распределены среди атомов азота, углерода и кислорода. В пептидной группе имеет место несколько переходов, наименьшая энергия характерна для  n à p*-перехода: n-электрон сконцентрирован на атоме кислорода, и этот переход запрещен по симметрии. Полоса n à p* поглощения в пептидах как правило отмечается при 210-220 нм, является очень слабой.
Например, проанализируем спектр поглощения различных структурных форм поли-L-лизина, рис.1Х. На рисунке представлены спектры аминокислот, находящихся в беспорядочном клубке при рН = 6, в виде α-спирали при рН =10.8, и, наконец, в β-слои при рН =10.8


Рис. 1 Спектр поглощения поли-L-лизина в водном растворе. I - беспорядочный клубок, рН 6.0, 250С; II - a-спираль, рН 10.8, 250С; III - b-слой, рН 10.8, 520С.
В случае a-спиральной конформации полимера n à p* - переход проявляется в виде маленького плеча очень слабо при α = 220 нм, при этом имеется сильная полоса, максимум которой около α=190 нм. Доказано, что эта интенсивная полоса определяется  p à p*-переходом при emax » 7000, а при еще более высоких частотах встречается и третий переход с α = 175 нм. Можно говорить, что это n à s* -переход.
Изменение рН оказывает незначительное влияние на спектры поглощения отдельных хромофорных групп пептидов хромофоров, но такие аминокислоты как тирозин и триптофан чувствительны к изменению среды, что связано тем, что центры протонирования напрямую связаны с системой электронного сопряжения хромофоров, особенно ярко, это проявляется у тирозина, наиболее ярко это проявляется в спектральном сдвиге у тирозина, когда отщепляется протон ОН-группы. Этот сдвиг можно зафиксировать, измеряв поглощение при λ =295 нм. За процессом титрования остатков тирозина следят, фиксируя разностные спектры при данной длине волны, график представлен на рисунке 3.

Рис.3 Спектрофотометрическое титрование панкреатической РНКазы быка.
На рисунке 3 по оси ординат отложены значения молярного коэффициента экстинкции в логарифмической шкале. Участки, которые отмечены сплошной линией, соответствуют данным, не зависящим от времени. В молекуле РНКазы насчитывается шесть тирозиновых остатков. На графике видно, что три остатка титруются обратимо, рКа=0,2, а оставшиеся три не титруются вплоть до денатурации белка
Значения рН среды не так влияет на поглощение триптофана, значения рКа триптофана определяется вне области значений рН, гле большинство белков сохраняет свою нативную конформацию.
Измерение поглощения цистеинов в белках затруднено тем, что наиболее длинноволновый интенсивный переход при λ=230 нм лежит в области поглощения характерной для пептидной группы. Полосы поглощения дисульфидных мостиков находятся в более длинноволновой области, от λ = 250 до λ = 270 нм, при этом интенсивность имеет низкое значение, e » 300, чтобы влиять на поглощении белковой молекулы, но. Несмотря на это, вклад этих переходов в общую оптическую активность белков достаточно велик.
Спектральные характеристике белков часто трудно определить так как имеются радикалы групп аминокислот, которые поглощают в той же области, что и пептидные группы. В случае если в белке имеется небольшое число сильно поглощающих остатков, то возможно провести однозначную идентификацию, а также провести анализ разных частей спектра, в тоже время присутствие в молекуле белка большого количества ароматических остатков мешает разделению спектра при λ = 200 нм на отдельные компоненты, которые отвечали бы радикалом и пептидной связи.
Часто в состав белков входят группы, которые не относятся к двадцатке аминокислот