Современные методы биохимического анализа, их использование в спорте; методы молекулярно-генетического анализа

Введение
Благодаря развитию генетики и молекулярной биологии (открытию структуры хромосом и ДНК, расшифровке генетического кода, расшифровке генома человека и т.д.) на настоящий момент разработан широкий спектр молекулярно-генетических методов [6].
Основная цель большинства молекулярно-генетических исследований заключается в выявлении изменений последовательности ДНК, которая является причиной нарушений в жизнедеятельности организма.
Кроме этого благодаря молекулярно-генетическим анализам в последнее десятилетние появилась возможность определения генетических маркеров, ассоциированных с развитием и проявлением физических качеств, а также с биохимическими, антропометрическими и физиологическими показателями, значимыми в условиях спортивной деятельности [5]. В связи с этим молекулярно-генетические исследования могут быть не только методом выявления заболеваний, но и механизмом отбора и тренировки спортсменов.
Цель данной работы – изучить, какие методы молекулярно-генетического анализа наиболее востребованы и эффективны на данный момент, и как их можно применить в спортивной деятельности.
Глава 1 Характеристика основных методов молекулярно-генетического анализа
Для применения в диагностических лабораториях разработаны несколько методов молекулярно-генетического анализа:
- классический цитогенетический анализ (кариотипирование);
- метод полимеразной цепной реакции (ПЦР);
- цитогенетический анализ с использованием флуоресцентных красителей (FISH);
- микрочипирование [7] и т.д.
1.1 Классический цитогенетический анализ
Цитогенетические исследования стали широко использоваться еще в первой половине ХХ века. В 1956 году цитологи Д.Тио и А.Левана определили, что у человека 46 хромосом. В 1959 году была установлена хромосомная природа болезни Дауна. В 1960 году была разработана Международная классификация хромосом, предложен метод получения метафазных хромосом из лимфоцитов периферической крови, культивируемых с фитогемагглютинином [9].
Цитогенетические методы нашли широкое применение для диагностики хромосомных болезней, при проведении исследований, направленных на изучение влияния мутагенных факторов, в т.ч. радиации.
Цитогенетические методы состоят в культивировании и получении метафазных клеток с последующим применением окрашивания хромосом по длине и исследованием кариотипа с помощью светового микроскопа. Долгое время этот метод был единственным способом идентификации хромосомных аномалий. Разработаны несколько способов дифференциального окрашивания хромосом, каждый из которых имеет характерные особенности. Самый популярный метод – G-окрашивание, который базируется на обработке препаратов хромосом перед окраской (инкубацией в солевых растворах и растворах протеолитических ферментов) и на использовании нефлюоресцентных красителей или их смесей. В результате окрашивания появляются чередующиеся темные и светлые полосы хромосом. По их числу, величине и расположению можно определить, имеет ли место хромосомная аномалия. Своевременное проведение хромосомного анализа имеет большое значение для выявления причин возникновения и прогнозирования многих наследственных и врожденных пороков развития. В России в практическом здравоохранении исследования кариотипа проводятся с 1966 года [10]. В ряде случаев применение этого метода невозможно или затруднено в связи со сложностью культивирования клеток большинства соматических тканей. Метод не дает возможность диагностировать хромосомные микроаберрации. Его разрешающая способность – 5-7 миллионов пар нуклеотидов [6].
1.2 Полимеразная цепная реакция
Метод полимеразной цепной реакции был изобретен в 1983-1985 гг К.Мюллисом. Его суть стоит в молекулярном клонировании. ПЦР позволяет амплифицировать (размножить) малые концентрации определенного небольшого участка генома (100-500 пар нуклеотидов) в биологическом материале (пробе). Кроме амплификации ДНК, ПЦР позволяет проводить другие манипуляции с нуклеиновыми кислотами –Введение

мутаций, сращивание фрагментов ДНК. ПЦР широко используется в медицинской и биологической практике для диагностики наследственных и инфекционных заболеваний, для установления отцовства, клонирование генов, выделения новых генов.
Разработке и широкому распространению метода ПЦР предшествовало открытие в 1975 году экстремально термофильной бактерии Thermus aquaticus. Фермент taq-полимераза этой бактерии способен стабильно работать при температуре 72-80оС [4].
Метод ПЦР основан на многократном избирательном копировании определенного фрагмента ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях. При этом происходит копирование только искомого участка в том случае, если он присутствует в образце [12].
Исходную молекулу ДНК нагревают, чтобы разрушить водородные связи, соединяющие комплементарные цепи. Этот этап называется денатурацией. Затем на этапе отжига смесь остужают в присутствии двух праймеров - коротких фрагментов ДНК, один из которых комплементарен участку ДНК слева от изучаемого локуса, а второй – участку другой нити справа от изучаемого локуса. Именно правильный подбор праймеров обеспечивает специфичность и чувствительность тест-системы. Праймер синтезируется искусственно, состоит из 15-30 нуклеотидов

. Он должен быть специфичен, т.к. именно с него идет синтез комплементарной цепи ДНК; не образовывать димеры и петли. Если в смеси нет последовательности ДНК, комплементарной праймерам, отжига не происходит [4].
Праймеры связываются с соответствующими участками ДНК и задают точку синтеза новой комплементарной цепи на матрице ДНК. Синтез осуществляет термостабильный фермент Taq-ДНК-полимераза. В качестве строительного материала в смеси присутствуют дезоксинуклеотидтрифосфаты.
В следующем цикле реакционную смесь с полученными нитями ДНК вновь нагревают для разделения комплементарных нитей, затем вновь остужают в присутствии праймеров. Цикл повторяют несколько раз. Каждый раз вновь полученные нити ДНК служат матрицей для синтеза новых нитей. При этом реплицируется только небольшой фрагмент между двумя праймерами. За 30 циклов количество синтезированных фрагментов составит около 1 миллиарда [2].
Для определения полученных фрагментов ДНК – ампликонов – их разделяют при помощи электрофореза в агарозном или полиакриламидном гелях. Через гель с образцами ДНК пропускают постоянный ток. Т.к. фрагменты ДНК отрицательно заряжены, они движутся к аноду. Чем меньше фрагмент, тем легче он проходит поры в геле и дальше уходит от линии старта. Все фрагменты ДНК движутся по одной дорожке в геле, но из-за разницы в длине и массе проходят разное расстояние. Фрагменты одного размера движутся с одной скоростью и после окрашивания выглядят как тонкая полоска (бэнд) в геле [2].
Процесс разделения ДНК в геле под действием постоянного электрического тока называют электрофорезом.
Рисунок 1 – Основные этапы ПЦР
Итого развития ПЦР стало создания метода ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ), при котором осуществляется измерение флоуресценции амплифицируемой смеси во время проведения циклов амплификации. ПЦР-РВ – самый точный и чувствительный метод обнаружения и количественного определения нуклеиновых кислот. Он избавлен от таких проблем классической ПЦР, как разработка гелей, перенос ДНК на мембрану, радиоактивное мечение пробы.
1.3 Цитогенетический анализ с использованием флуоресцентных красителей (FISH).
Возможности цитогенетического анализа расширились благодаря развитию метода флюоресцентной гибридизации in situ – FISH-метод. Он позволяет проводить гибридизацию метафазных или интерфазных хромосом с различными ДНК-зондами. Зонд – выделенный или клонированный участок ДНК, комплементарный участку ДНК исследуемого кариотипа и меченный флюоресцирующими веществами. Чаще всего используют высокоповторяющиеся последовательности ДНК центромерных районов; при необходимости – уникальные ДНК-последовательности.
На первом этапе подготавливают зонд – готовят однонитевой участок ДНК, к которому присоединяют метки (биотин или дигоксигенин). На микроскопическом препарате денатурируют ДНК – разрывают водородные связи между двумя нитями. Препарат обрабатывают ДНК-зондом. Зонд присоединяется к соответствующему участку хромосомы – стадия гибридизации. Можно одновременно использовать несколько разных зондов, которые присоединяются к разным локусам. Двойная спираль восстанавливается. Полученный препарат обрабатывают химическими веществами, которые способны избирательно присоединяться к метке – биотину или дигоксигенину. К полученным комплексам присоединяют флоуресцентные красители (флюорохромы). С помощью люминесцентного микроскопа окрашенные хромосомы видны на фоне неокрашенных [10].
Метод FISH применяется для различных целей – от локализации гена до расшифровки перестроек между несколькими хромосомами. Его можно применять для диагностики интерфазных ядер, что снимает необходимость приготовления препаратов метафазных хромосом. FISH на интерфазных хромосомах используется для пренатальной диагностики трисомий по 21,18 и 13 хромосомах. При использовании классического цитогенетического анализа доля невыявленных случаев составляла 10%, при использовании FISH – всего 0,9-1,5% [10].
Подобным же способом осуществляется метод сравнительной геномной гибридизации (comparative genomic hybridization – CGH). Отличие заключается в том, что гибридизация на хромосомах проводится с использованием меченых одним флюорохромом геномной ДНК пациента и другим флюорохромом ДНК донора. Затем с помощью цифрового анализа проводится сравнительная оценка интенсивности суперпозиции сигналов двух разных флюорофоров, за счет чего становится возможным определение потери или приобретения участка ДНК у пациента [6].
1.4 Диагностика с использованием биологических микрочипов
Биологические микрочипы – набор молекул ДНК (реже - белков), упорядоченно размещенных и зафиксированных на специальном носителе, т.н. платформе из пластика, стекал, кремния и т.д. На каждом микрочипе может располагаться от нескольких десятков до нескольких сотен тысяч микротестов или проб.
При добавлении анализируемого образца содержащаяся в нем ДНК по принципу комплементарности соединяется с ДНК пробы – гибридизируется. Анализируемые молекулы ДНК метятся с помощью флоуресцентной или радиоактивной метки. Благодаря меткам можно определить, в каких ячейках произошла гибридизация, и соответственно – какие последовательности ДНК есть в анализируемом образце. Обычно вместе с анализируемой ДНК используют тестовую ДНК с известной последовательностью нуклеотидов