Промышленные способы стерилизации и контроля чистоты оборудования и коммуникаций

Введение

Стерилизация - полное уничтожение всех видов микроорганизмов.
Микроорганизмы отличаются друг от друга устойчивостью к различным воздействиям (высушиванию, свету, облучению, вакууму, давлению, холоду, нагреванию, химическим веществам). Как правило все микроорганизмы более чувствительны к влажному теплу, чем к сухому. Очень важным фактором, оказывающим влияние на термостойкость микроорганизмов, является среда, в которой они находятся. Например, терморезистентность особенно высока в масляных продуктах, молодые споры менее устойчивы, чем старые.
Таким образом, методы стерилизации должны быть дифференцированными и они не должны изменять свойств обрабатываемого материала. Во всех случаях надо стремиться, чтобы время стерилизации по возможности было непродолжительным.
Условно методы стерилизации можно разделить на:
- термические (паровые и сухожаровые),
- на физические (с помощью лучистой энергии) ,
- химические ( с использованием химических агентов в виде газов или растворов),
- мембранные (фильтрованием).


1.Термические методы стерилизации
Преимущества термических методов стерилизации:
- надёжность,
- отсутствие необходимости удаления стериизующих агентов из стерилизуемых объектов,
- технологическая простота,
- возможность стерилизации объектов в упаковке, что позволяет сохранять стерильность определённый период времени.
К этому виду обработки относятся прокаливание на огне, фломбирование, кипячение, стерилизация текучим паром, паром под давлением и при разряжении (низкотемпературный пар), пастеризация, тиндализация.
Кипячение - процесс доведения воды до кипения.
При кипячении погибает большинство вегетативных форм микроорганизмов, поэтому его широко используют при стерилизации предметов и материалов, не портящихся при такой обработке. Добавление бактерицидных веществ увеличивает скорость и надежность стерилизации кипячением. Недостатком метода является то, что при этом споры погибают не всегда.
Пастеризация это однократное нагревание жидкостей при температуре около 60 град. C в течение 60 мин. или 70-80 град в теч. 30 мин. Пастеризация проводится с целью уничтожения вегетативных форм микроорганизмов, споровые формы при этом методе теплового воздействия сохраняют жизнеспособность. Поэтому пастеризованные объекты хранят непродолжительный период времени при пониженных температурах. Пастеризация применима для термочувствительных биологических жидкостей. Считается , что все биологически значимые соединения при этом методе воздействия сохраняются в неизменном виде.
Технология предложена в 19 веке Луи Пастером
Тиндализация- способ стерилизации, предложенный Дж. Тиндалем
Её чаще всего проводят при 3-6 кратном нагревании (дробная стерилизация) в теченние 20-60 мин при 100 град. С с интервалом в 24 ч. В промежутках между нагреванием стерилизуемый материал выдерживают при 24-37 град С для возможности прорастания спор с целью их уничтожения при очередной стерилизации.
С помощью тиндализации стерилизуют биологические жидкости, содержащие кровь, сыворотку. Метод достигает цели, когда споры находятся в среде пригодной для их прорастания, и среда не содержит ингибиторов роста, а также при условии, если инкубация между циклами стерилизации проводится при благоприятных для прорастания спор температуре и других условиях.
Метод не пригоден в случаях, когда оптимальная температура роста микроорганизмов выше температуры прогревания или инкубации (например у некоторых термофилов), а также для культур у которых споры в промежутках стерилизации не прорастут, если стерилизуемая среда непригодна для прорастания спор или содержит ингибиторы, если в ней имеются споры облигатных анаэробов, которые в аэробных условиях не прорастут и следовательно не погибнут. Кроме того, при повторном и продолжительном нагревании сред, содержащих углеводы и фосфаты, могут видоизмениться полисахариды и сахара и образоваться нежелательные продукты. Агар и желатина, например, могут потерять гелеобразующие свойства особенно, если среда сильнокислая или сильнощелочная.
Общим недостатком методов дробной стерилизации является большие затраты времени, а достоинством то, что не требуется специальная аппаратура и возможность проводить процесс стерилизации в щадящих условиях.
Паровая стерилизация осуществляется с помощью насыщенного водяного пара без и под давлением. Сочетанное воздействие на микроорганизмы влажностью и высокой температурой является основой парового метода стерилизации.
Стерилизующий эффект пара связан с прогреванием объекта в процессе конденсации пара на поверхности и внутри объекта. Эффект конденсации оптимален у насыщенного пара, содержанием 3% воды. Перегретый пар, содержващий менее 2 % воды может сжечь объект, а влажный пар с содержание влаги более 3% сильно увлажняет стерилизуемые объекты.
Стерилизация текучим паром
Текучим называется насыщенный водяной пар (без примеси воздуха), имеющий давление 760 мм рт. ст. и температуру 100 °С. Стерилизацию текучим паром осуществляют в паровом стерилизаторе при 100 °С в течение 30-60 мин в зависимости от объема раствора. Это один из распространенных методов стерилизации инъекционных растворов в аптеках. Если пар поступает централизовано из котельной, то перед вводом его в камеру сосуда должны иметься специальные устройства (ловушки пара), удаляющие конденсат, образующийся в коммуникациях при движении от источника пара до автоклава.
Стерилизуемый материал, как и в других случаях тепловой обработки, располагают так, чтобы между объектами оставалось пространство для свободной циркуляции пара. Длительность стерилизации после достижения в аппарате 100 град С и выхода из камеры полной и непрерывной струи пара может быть различной - от нескольких минут до 1-1,5ч в зависимости от вида, массы, объёма, плотности упаковки и свойств материала, его термостабильности, загруженности камеры.
Текучим паром стерилизуют питательные среды, растворы сахаров, аммиачные соли, мочевину, молоко, картофель, некоторые соли и реактивы, а также лабораторную продукцию и материалы, разрушающиеся при нагревании под давлением.
Стерилизацию обычно проводят 3 сут. подряд, по 30 мин ежедневно (дробная стерилизация). В промежутках между стерилизациями материал, как и при других методах дробной стерилизации, выдерживают при температуре 24- 37 град С. Этот метод обеспечивает гибель только вегетативных форм микроорганизмов, споры же в промежутках между циклами стерилизации прорастают и погибают только при повторной стерилизации.
Стерилизация паром под давлением
Такой способ наиболее надежен при уничтожении микроорганизмов и спор. Его проводят в автоклавах разнообразных по размерам, рабочему давлению, конструкциям, степени автоматизации и другим показателям. Повышение давления повышает точку кипения воды и соответственно температуру пара.
Для стерилизации в автоклаве используют насыщенный пар, который соприкасается с холодными предметами и при этом происходит быстрая конденсация и нагревание. Из стерилизуемого объекта вода не испаряется. Благодаря этому удаётся избежать обезвоживания таких материалов как резина, ткани, бумага, разрушающиеся в процессе нагревания при той же температуре сухим жаром.
Считается что при 121градС живые клетки погибают в течении 10 мин, большинство спор - после 5 мин экспозиции. Споры термофильных видов при таком воздействие погибают лишь через 23 мин, а споры, содержащиеся в земле - через 25 мин.
При изучение влияния различных режимов тепловой стерилизации в автоклавах на питательные среды, используемые для биосинтеза пенициллина и эритромицина, и изменения биохимических свойств компонентов этих сред, установлено, что оптимальных для достижения высоких показателей активности и надежности стерильности является режим: Т=120град С±1, время= 25мин.
Описаны бактерии выдерживающие температуру 350 град С и давление 265 атм.
Стерилизация при пониженном давлении (низкотемпературный пар)
Пар нагретый до 80 град С рекомендуется для дезинфекции пластмассовых, а также сложных и чувствительных к нагреванию материалов. Метод основан на том, что воздух из автоклава тщательно удаляется при помощи вакуума после чего камера заполняются паром и формалином. При пониженном давлении легколетучие соединения переходят в пар. Количество используемого формалина и способ его введения зависит от типа стерилизатора. На этот метод нет тестов контроля с использованием химических индикаторов.
Суховоздушная стерилизация
Этот метод рекомендуется для материалов, портящихся от воздействия пара (коррозия и др.) и непроницаемых для пара: стеклянная посуда, пипетки завернутые в бумагу, пергамент или подпергамент, вата, пробирки, колбы, флаконы, металлические предметы и другие термоустойчивые материалы.
Растворы, содержащие воду и органические вещества, при таком методе стерилизации могут стать непригодными. Следует также избегать стерилизации этим методом масел, если в них содержится много воды, а также органических веществ, животных и растительных тканей и волокон. В первом случае может произойти закипание, выброс и воззагорание, а во втором - изменение и порча среды.
При суховоздушной, и при автоклавировании действующим фактором является теплота, однако стерилизация происходит в воздушной среде, что существенно изменяет характер прогрева и его действие на микроорганизмы. При этом методе стерилизации происходит перенос теплоты путем теплопроводности, конвекции и лучистой энергии. Трудности расчета и регулирования суховоздушной стерилизации связаны со сложным распределением температуры по отдельным точкам по зонам камеры.
Суховоздушная стерилизация наиболее эффективна при свободном размещении стерилизуемого материала на решетчатых полках и при принудительной циркуляции воздуха в печи. Следует иметь в виду, что даже при правильном размещении стерилизуемого материала в камере трудно достичь его равномерного прогревания.
Недостаток суховоздушной стерилизации - медленное прогревание. Скорость прогревания зависит от ряда факторов (плохая передача тепла от воздуха к стерилизуемому предмету, масса предмета и его поверхность, вид и теплопроводимость стерилизуемого материала, конструкция стерилизатора, количество полок). Имеют значение также способ размещения стерилизуемого материала, объем и упаковка стерилизуемых предметов, характеристика циркуляции воздуха, т.к. при недостаточной циркуляции воздуха могут возникать большие перепады температуры в различных участках камеры и воздушных карманах с разницей до 30 град С.
Другой недостаток суховоздушной стерилизации слабая и неравномерная проницаемость жара и вредное действие его на некоторые материалы (ткани, кожа, бумаги).
Однако в целом суховоздушная стерилизация - достаточно надежный метод для обработки материалов, в которые пар трудно проникает (например воска масла). Резистентные микроорганизмы, находящиеся в глубине этих веществ не погибают при паровой стерилизации, несмотря на то, что температура при автоклавировании может достигнуть 121 град С.
Гибель микроорганизмов при стерилизации сухим воздухом, по мнению большинства исследователей, связана с инактивацией клеточных белков и ферментов. Бактерицидное действие сухого горячего воздуха значительно слабее чем влажного пара при одной и тойже температуре. Так вегетативные формы микроорганизмов при температуре сухого воздуха 100 град С погибают через 1,5 ч, споры при 140 град С через 2 -3ч, а отдельные виды спор - при 170- 200 град С через 2ч. При воздействии пара они погибали значительно быстрее.
Резистентность микроорганизмов к суховоздушной стерилизации зависит от ряда факторов: вида культуры, характера стерилизуемого материала, массы упаковки, содержания влаги в стерилизуемом материале. Так при содержании влаги 50% яичный альбумин коагулирует при 56 град, при полном отсутствии влаги - при 160-170 град С. Чаще всего суховоздушную стерилизацию проводят при температуре 160-170 град С в течение 1-4ч

. Описаны культуры, споры которых погибают через 139 ч суховоздушной стерилизации.
Продолжительность суховоздушной стерилизации зависит и от физико- химических свойств материала, теплоемкости и теплопроводимости, массы, формы и плотности упаковки и т.д. Существует зависимость температуры и длительности стерилизации: при 170 град С-1ч; при 160 градС-2ч; при 150 град С-2,5ч; при 140 град С-3ч, при 120 град С-6ч. Однако по мнению некоторых исследователей температуру лучше не поднимать выше 160 град С. В противном случае из ваты и некоторых сортов бумаги выделяются ингибирующие рост микроорганизмов соединения. Эти вещества могут выделяться и при более мягком режиме стерилизации, но в значительно меньших количествах.
При охлаждение камеры они конденсируются, поэтому стенки камеры периодически следует очищать. При стерилизации в суховоздушных шкафах открывать камеру можно только после ее охлаждения иначе при резкой перемене температуры стеклянная посуда может лопнуть, а в результате притока кислорода некоторые соединения способны к возгоранию.


2. Стерилизация фильтрованием
Стерилизацию фильтрованием проводят главным образом для термолабильных растворов - сывороток, токсинов, анатоксинов, некоторых питательных сред, лекарственных препаратов, т.е. когда при нагревании или других методах стерилизации свойства обрабатываемого продукта могут значительно измениться. Этот метод используют и в случаях, когда возможна тепловая стерилизация, но кроме микроорганизмов нужно удалить и субмелкие частицы. Фильтрование можно применить при очистке от микроорганизмов и частиц пыли различных растворов, аэрозолей, эмульсий и воздуха. В отличие от других методов, когда умерщвленные микроорганизмы остаются в стерилизуемом продукте и могут быть причиной различных не желательных явлений (в частности пирогенности), при фильтровании клетки м.о. удаляются из стерилизуемого продукта.
Эффективность фильтрации зависит главным образом от размера пор фильтров, структуры и поверхности фильтра, скорости фильтрования, размера частиц фильтруемой жидкости, ее химических свойств (она должна быть инертна по отношению к материалу фильтра), рН (щелочные жидкости с рН 7,2- 8,0 фильтруются легче), давления.
Материалы, понижающие поверхностное натяжение (сыворотки, желчь, кислоты, мыла и лаурилсульфат натрия) способствуют проникновению микроорганизмов через фильтр содержащий кремний. Скорость фильтрования повышается с повышением температуры. Необходимо иметь в виду, что некоторые виды м.о. могут быть фильтрующимися или находится в L-форме, что нарушит эффективность стерилизации.
В некоторых случаях перед фильтрованием жидкость центрифугируют или предварительно фильтруют для отделения грубых частиц, снижающих скорость и эффективность стерилизации фильтрованием.
2.1. Фильтрующие материалы и устройства
Для стерилизации используют фильтры изготовленные из материалов с различными физическими и химическими свойствами, пропускной и адсорбционной способностями. Так фильтры из нитрата целлюлозы неустойчивы к кетонам, сложным эфирам, низкомолекулярным спиртам. Они пригодны для работы в пределах рН 1-10. Фильты из поликриамида пригодны для работы при рН 5-12 и устойчивы ко многим органическим растворителям. Устойчивы почти ко всем органическим растворителям и концентрированным кислотам и щелочные фильтры из политетрафторэтилена (фторопласта).
Для стерилизации фильтрованием применяют такие фильтры-свечи различных конструкций (Шамберлана, Беркефельда), фильтры Зейтца.
2.2. Стеклянные фильтры
Фильтрующим элементом являются пластины из мелкопористого стекла. Наибольшая пористость 250-100мкм (фильтр ОО) наименьшая 1-1,5мкм. Для стерилизации используют фильтры с диаметром пор менее 2 мкм.
Стеклянные фильтры имеют отрицательный заряд, слабее адсорбируют растворенные вещества при фильтрации, не загрезняют фильтрат. Их можно стерилизовать теплом и обрабатывать кислотами. Скорость фильтрования через стеклянные фильтры относительно низкая.
После употребления стеклянные фильтры обеззараживают, затем промывают дистиллированой водой, пропуская ее в обратном фильтрованию направлении. После этого фильтр заливают на 10-12 ч концентрированной серной кислотой с небольшим количеством нитрита натрия и хлорида кальция, промывают многократно дистиллированной водой и кипятят. Нельзя допускать засорения пор стеклянных фильтров.
Широко распространены фильтры Нутча и воронки Бюхнера. в которые впаяны пластины из мелкопористого стекла с порами 30-120мкм.
2.3. Мембранные фильтры и ультрафильтры
Обычно это диски толщиной 0,1мм и диаметром до 50 мм, изготовленные из ацетата целлюлозы и нитроцеллюлозы, ацетилцеллюлозы, полиамида, политетрафторэтилена.
Мембранные фильтры пронизаны множеством лабиринтных отверстий, соединяющих верхнюю часть диска с нижней. Поверхность их с одной стороны гладкая с другой шероховатая. Мембранные фильтры и ультрафильтры различаются в основном величиной и многослойностью структуры пор (у ультрафильтров диаметр пор 100мкм и меньше). Мембранные фильтры чаще используют для отделения или удаления бактерий, а ультрафильтры - для выделения вирусов и высокомолекулярных белков, поэтому их еще называют коллоидными .
У нас в стране в микробиологии используют химически стойкии мембранные фильтры " Владипор" микрофильтрационные ацетатные МФА-АА и МФА-А и ультафильтрационные ацетатные мембраны (УАМ)(таб.1.)
Таблица 1
Характеристика фильтров "Владипор"
Марка фильтра средний диаметр пор мкм
УАМ-50 неболее 0,005
УАМ-100 0,005-0,01
УАМ-300 0,02-0,03
УАМ-500 более 0,03
МФА-МА№1 0,05-0,15
МФА-МА№3 0,251-0,35
МФА-МА№5 0,451-0,55

Эти фильтры разработанны на основе ацетата целлюлозы. Они обладают слабой сорбционной способностью не горючи не токсичны для животных пригодны для работы в диапазоне рН от 1до10,0 и в присутствии спирта.
Мембранные фильтры широко применяются в лабораториях при бактериологических исследованиях воздуха, воды и различных жидкостей, а также антибиотиков и других веществ на присутствие в них бактерий. Для этих целей можно использовать отечественные фильтры марок МФА-МА и МФА-А с размерами пор 0,45-0,2мкм или фильтры "Миллипор" марки НА.
За рубежом мембранные фильтры производят фирмы "Millipore Intertech" (США) "Sartorius Werke GmbH"(ФРГ) "Full Europe Ltd" (Великобритания) "Synpor" (Чехо-Словакия). Сравнительно недавно фирма "Micron Separation Inc" собщила о производстве новых мембранных фильтров из ацеттата целлюлозы имеющих размер пор от 0,2 до 10мкм. Эти фильтры связывают незначительное количества белка и предназначены для использования в диагностических иследованиях при проведении которых нужно исключить потери белка.
Мембранные фильтры непригодные для длительного фильтрования, поскольку их поры закупориваются.
Некоторые микроорганизмы (стрептомицеты) могут прорастать через поры некоторых мембранных фильтров.
Достоинства мембранных фильтров - сравнительно большая скорость фильтрования, малая адсорбционная способность. Кроме того, все клетки микроорганизмов из большого количества фильтруемой жидкости (воды мочи молока разведенной крови) накапливаются на маленьком участке- диске и можно исследовать стерильность фильтратов по количеству проросших на диске колоний.
Стерилизовать мембранные фильтры можно при автоклавировании, а также при помощи оксида этилена в смеси с диоксидом углерода (время экспозиции 6ч) или 2%-го раствора формальдегида (экспозиция 24ч). После этого фильтры необходимо проветрить в стерильных условиях.
При фильтровании растворов на мембранных фильтрах могут адсорбироваться токсичные катионы. В результате высокой концентрации этих катионов на поверхности фильтров уменьшается количество колоний вырастающих на них. Поэтому их, по завершении процесса фильтрации, в случае изучения общего количества микробных клеток, содержащихся в исследуемой жидкости, промывают стерильной водой.
Мембранные фильтры применяют для удаления пирогенных веществ из лекарственных препаратов, используемых для парентерального введения.
3. Стерилизация облучением
Этод метод относится к физическим методам. Бактерицидный и стерилизующий эфекты достигаются различными видами облучения инфракрасными (ИК), ультрафиолетовым (УФ), рентгеновскими лучами, альфа, бета и гамма лучами радиоактивных элементов, катодными лучами генерируемыми на ускорителях частиц.
3.1. Инфракрасные и ультрафиолетовые лучи
Бактерицидное действие ИК-лучей на микроорганизмы зависит от длины волны, интенсивности и длительности облучения объекта. При длине волны 0,7- 1,4 мкм они глубоко проникают в ткани человека, а более длинные лучи оказывают лишь тепловой эфект. ИК лучи используют для стерилизации хирургических инструментов и некоторых материалов.
УФ лучи можно использовать от любых источников и обрабатывать продукты питания, воздух в закрытых помещениях, поверхности лабораторного оборудования, биологические жидкости и воду в тонком слое. Мощность УФ лучей измеряется в бактак (единица бактерицидного потока частиц с длиной волны 0,254мкм, мощностью 1Вт приходящаяся на площадь 1м2 ) и выражается соответствующими единицами измерения б/м2 или мкб/м2 .
Доза УФ излучения губительная для различных видов микроорганизмов (кроме спор) составляет 5 мкб/см2 . 90% патогенных микроорганизмов погибают при интенсивности УФ облучения 1,5-5мкб/см2 .Губительное действие УФ лучей обусловлено изменением колоидной системы микробной клетки. Чувствительность микроорганизмов к этому облучению зависит от множества факторов: вида культуры и ее физиологического состояния; состава среды в которой они находятся, источника излучения, экспозиции, упаковки стерилизуемого материала и др. Более чувствительным к обработке УФ лучами грамотрицательные микроорганизмы, в лаг фазе роста, кислой среде, при наличии в облученном объекте паров бактерицидных, химических и других веществ и тд. Более устойчивы к облучению споры бактерий и плесеней, туберкулезная палочка, старые культуры и культуры в щелочных условиях при наличии в облучаемом объеме взвешенных частиц пыли и др.
3.2. Радиационная стерилизация
Кобальт-60, цезий-137, уран, торий, радий и некоторые другие элементы самопроизвольно непрерывно испускают невидимые лучи, которые подобно рентгеновским, способны проникать через плотные материалы и вызывать ионизацию с образованием активных ионов-радикалов. В магнитном поле пучек радиоактивных лучей разделяется на три части: положительно заряженные альфа- частицы, отрицательно заряженные бета- частицы и нейтральные гамма- лучи. Последние обладают способностью проникать через бумагу, дерево, стекло, метал и другие материалы и вызывать ионизацию субстрата жизнедеятельного микроорганизма с образованием активных ионов (радикалов), что нарушает обмен веществ в клетке и приводит к ее гибели.
Достоинством источников гамма излучения для стерилизации продуктов питания и медикаментов (выдерживающих и не выдерживающих тепловую обработку) является то, что они обладают высокой проникающей способностью, достаточной мощностью и обеспечивают бактерицидное и стерилизуюшее действие в течении короткого промежутка времени. При этом не возникает наведенной радиоактивности и температура объекта почти не повышается. Это позволяет использовать гамма лучи для стерилизации термолабильных лекарственных и других медицинских препаратов, различных биологически активных веществ. Кроме того точное измерение поглощенной энергии с помощью дозиметров позволяют исключить необходимость проверки на стерильность дорогостоящими микробиологическими методами.
Достоинства ионизирующего излучения и наличие мощных установок позволяют осуществлять стерилизацию различных продуктов, в том числе медицинского назначения, и материалов в товарной упаковке, создать конвейрный метод, а также механизировать и автоматизировать процесс.
Для радиационной стерилизации принято пользоваться единицей поглощенной энергии радиан (радиационная абсорбционная доза, рад) равной 100 эрг/г вещества или мегарадиан (Мрад)