ПЦР в реальном времени

Введение

Активное использование методов молекулярно-генетической диагностики в практике клинико-диагностических и научных лабораторий обусловливает необходимость правильной организации работы с нуклеиновыми кислотами. Наиболее распространены методы, в основе которых лежит принцип полимеразной цепной реакции (ПЦР), способной увеличивать количество копий исходного образца в миллионы раз в течение нескольких часов. В основе метода ПЦР лежит принцип умножения исходной ДНК матрицы в геометрической прогрессии в процессе прохождения температурных циклов.
Полимеразная цепная реакция представляет собой метод ферментативной наработки in vitro определенных, сравнительно коротких, двухцепочечных фрагментов ДНК. В основе реакции лежит механизм, который в природе реализован при внутриклеточном удвоении молекул ДНК ферментом ДНК-полимеразой [1].
ПЦР в реальном времени характеризуется возможностью проведения качественного и количественного анализа. Регистрируемое в процессе амплификации нарастание сигнала от отделенного флуорофора прямо пропорционально увеличению концентрации синтезированных специфических продуктов и отражает концентрацию ДНК в исходной матрице.

История появления ПЦР в реальном времени

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) известна уже более четверти века и в настоящее время применяется для решения широкого круга научных и практических задач, что обусловлено относительной простотой данного метода, высокой чувствительностью и надежностью при небольшой себестоимости.
Долгое время анализ результатов ПЦР проводился по окончании реакции с помощью гель-электрофореза и получил название «анализ по конечной точке». Однако такой анализ подразумевает дополнительные манипуляции, связанные с контактом продуктов амплификации (ампликонов) с внешней средой, что не исключает загрязнение ими лабораторного пространства. Уже в 90-х годах прошлого столетия все более очевидным становился недостаток ПЦР, являющийся следствием ее главного преимущества - уникальной чувствительности, позволяющей получать необходимое количество ДНК из единичных копий исходной матрицы. Этот недостаток - угроза получения ложно-позитивных результатов в силу возможного загрязнения исследуемых проб - серьезно ужесточил требования к оснащению лабораторий и к условиям работы. Второй причиной, потребовавшей усовершенствования метода ПЦР, стала необходимость измерения количества ДНК-матрицы в исследуемом материале, что практически невозможно было осуществить при помощи классической ПЦР «по конечной точке».
С целью преодоления указанных проблем стал проводиться поиск способов проведения ПЦР таким образом, чтобы накопление продуктов амплификации можно было контролировать непосредственно в ходе реакции. В результате счастливой «ошибки», допущенной одним из сотрудников R. Higuchi, который провел ПЦР в присутствии ин-теркалирующего красителя - бромистого этидия, считавшегося сильным ингибитором ДНК-полимеразы, была предложена ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Новый вариант изначально был назван кинетической ПЦР, т.к. измерение аналитического сигнала позволяет построить кинетическую кривую процесса.
Разработка ПЦР-РВ повлекла за собой создание нового типа ДНК-амплификаторов, оснащенных оптическим модулем и способных детектировать изменение флуоресценции образцов в каждом цикле амплификации. Это обусловило ряд существенных преимуществ: высокую специфичность детекции, сведение к минимуму риска получения ложнопозитивных результатов, возможность количественной оценки исходной ДНК, сокращение времени анализа, автоматическую регистрацию и интерпретацию полученных данных в электронном формате [2].


Этапы ПЦР в реальном времени
Метод ПЦР включает следующие основные этапы:
1)пробоподготовка;
2)получение препаратов нуклеиновых кислот (выделение);
3)проведение полимеразной цепной реакции (амплификация);
4)анализ полученных продуктов ПЦР (детекция).

Рис.3. Последовательные стадии ПЦР.
1. В состав реакционной смеси наряду с праймерами и остальными компонентами реакции добавляются специальные флуоресцентные метки (зонды). Флуоресцентный зонд представляет собой олигонуклеотид, комплементарный внутренней последовательности амплифицируемого фрагмента ДНК возбудителя. На 3’-конце зонда находится флуоресцентная молекула – флуорофор, а на 5’-конце расположена молекула-“гаситель” флуоресценции. За счет близости флуорофора и “гасителя” вся энергия, поглощенная флуорофором, переходит на “гаситель” по принципу флуоресцентно-резонансного переноса энергии. При этом сигнал флуоресценции отсутствует.

2. В ходе ПЦР при повышении температуры происходит денатурация ДНК возбудителя, и зонд наряду с праймерами гибридизуется с комплементарным участком ДНК.


3

. В процессе синтеза новой цепи ДНК, фермент ДНК-полимераза расщепляет этот зонд. При расщеплении зонда флуорофор отделяется от “гасителя”, расстояние между ними увеличивается, процесс тушения флуоресценции становится невозможным. В этот момент можно зарегистрировать флуоресцентный сигнал от флуорофора [2, 3].


Основы ПЦР в реальном времени. Зонды

Метод ПЦР-РВ основан на использовании флуорохромов - молекул, обладающих способностью к свечению в результате поглощения световой энергии.
Для постановки ПЦР в реальном времени необходим специальный амплификатор, отличительной особенностью которого является возможность возбуждать и детектировать флуоресценцию, отражающую накопление ампликонов, на каждом цикле амплификации.
Первоначально ПЦР в реальном времени базировалась на применении интеркалирующих красителей (ИК) - органических соединений, способных к нековалентному связыванию с одно- и/или двуцепочечной ДНК, приводящему к значительному усилению флуоресценции. Помимо бромистого этидия для этой цели были предложены красители группы SYBR (SYBR Green I, SYBR Gold), LCGreen, SYTO 9, YO-PRO, BEBO и ряд других.
Однако невысокая специфичность ИК стимулировала поиск новых аналитических систем, приведший к разработке способов детекции, основанных на использовании олигонуклеотидных гибридизационных зондов (проб). В настоящее время предложено уже более трех десятков подходов; но лишь немногие из них нашли коммерческое применение.
В целом, гибридизационные зонды представляют собой олигонуклеотиды, меченые в разных сочетаниях одним или несколькими флуоресцентными красителями и тушителями флуоресценции по концам и/или внутри цепочки, функционирующие по отдельности или в паре, обеспечивающие «включение-выключение» флуоресценции и дающие изменение интенсивности флуоресцентного сигнала за счет процессов внутри- и межмолекулярного переноса энергии при образовании вторичных структур.
Известно несколько механизмов передачи энергии возбуждения, однако в гибридизационных зондах реализуется резонансный перенос энергии флуоресценции, который основан на обмене энергии между двумя фотоактивными молекулами или группами, одна из которых выступает донором (первый флуоресцентный краситель), а другая -акцептором (второй флуоресцентный краситель или «темновой» тушитель) энергии. Эффективность переноса энергии зависит от взаимного расположения донора и акцептора, она максимальна на расстояниях порядка 1-10 нм. В качестве флуоресцентных красителей используются преимущественно флуорохромы ксантенового, родаминового и цианинового рядов, в качестве тушителей - соединения, содержащие в молекуле азогруппу. Однако поиск эффективных пар «флуорофор-тушитель» до сих пор остается актуальным.
Преимущество использования в качестве гибридизационных зондов олигонуклеотидов, меченых флуоресцентными красителями, составляющих пару «донор энергии - акцептор энергии», впервые было продемонстрировано в классической работе. Поскольку перенос энергии происходит лишь при нахождении красителей в составе единой структуры (в данном случае - двуцепочечной молекулы ДНК) и на определенном расстоянии друг от друга, нет необходимости удаления несвязавшихся проб, т.к. возбуждается краситель-донор, а регистрируется свечение красителя-акцептора. Варианты зондов, включающие различные виды используемых репортерных групп и их взаимное расположение, будут рассмотрены ниже.
Детекция результатов ПЦР с помощью интеркалирующих агентов Использование различных красителей, способных аналогично бромистому этидию связываться с ДНК и при этом увеличивать квантовый выход флуоресценции, оказалось простым и недорогим способом проведения ПЦР-РВ (рис. 1).

Рис.1. Детекция результатов ПЦР с помощью интеркалирующих красителей на примере SYBR Green I. Краситель не интеркалирует, свечения нет (слева) и краситель интеркалирует, свечение есть (справа).
В настоящее время для этой цели широко применяется краситель SYBR Green I с длиной волны испускания 520 нм, флуоресценция которого возрастает более чем в 100 раз в присутствии двуцепочечной ДНК. Однако в высоких концентрациях SYBR Green I ингибирует ДНК-полимеразу, что приводит к получению ложно-отрицательных результатов.
Главным недостатком использования всех ИК является способность связываться с любой двуцепочечной ДНК, появляющейся в реакционной смеси, которая может быть как целевым продуктом ПЦР, так и артефактом. Поэтому для получения корректных результатов необходимо дополнительное изучение продуктов амплификации с помощью «плавления» ампликонов. В связи с этим ПЦР-РВ с интеркалирующими красителями, несмотря на дешевизну и удобство, в практической ДНК-диагностике должна использоваться достаточно осторожно [4]