Наночастицы золота в хитозане и их получение и применение

Введение
В последние десятилетия интенсивно развиваются исследования в области синтеза, сборки и модификации новых наноструктурированных органо-неорганических сополимеров, содержащих наноразмерные частицы металлов и их оксиды [1]. Интерес к подобным системам вызван благодаря комплексу необычных физико-химических и оптико-электрических свойств, проявляющихся при переходе от микро- к наноразмерному состоянию. К числу таких свойств относятся стабильность фотофизических характеристик, химическая стабильность, высокая проницаемость и пролонгированное действие [2]. Среди наноразмерных частиц металлов особое внимание получили наночастицы золота, поскольку они обладают высокой каталитической эффективностью, бактерицидным эффектом, являются менее токсичными по сравнению с другими металлическими наночастицами, биосовместимы, отличаются хорошей электропроводностью и высокой удельной поверхностью [3]. В результате чего нанокомпозиционные материалы на основе наночастиц золота могут быть использованы в электронных, оптических, сенсорных устройствах, для адресной доставки лекарственных веществ в организме, а также для диагностики и лечения раковых заболеваний [2].
Наноразмерные частицы золота являются типичными лиофобными коллоидами с избытком поверхностной энергии и низкой агрегативной устойчивостью. По этой причине при их получении необходимо использовать различные стабилизаторы [4]. Наночастицы золота, обладая большой площадью контактной поверхности и биосовместимостью, имеют огромный потенциалом в области биотехнологии и биомедицины для обнаружения белков и ДНК, диагностики и терапии рака, а также для доставки лекарств. Однако применение наночастиц золота в живых системах требует использования биосовместимого и нетоксичного стабилизатора, выполняющего одновременно функцию транспортного средства [5,6]. С этой точки зрения перспективным представляется использование в качестве экранирующего агента природного полимера хитозана (ХТЗ). Интерес к ХТЗ связан с уникальными физиологическими и экологическими свойствами, такими как биосовместимость, биодеструкция, гипоаллергенность, физиологическая активность при отсутствии токсичности, доступность сырьевых источников [5].
1.1 Наночастицы золота
. Наночастицы (НЧ) представляют собой образования, которые состоят из связанных атомов и молекул размером от 1 до 100 нм. Наночастицы включают в себя от нескольких десятков до ≈106 атомов. Все нанодисперсные системы принято относить к объектам коллоидной химии [7]. Коллоидная частица золота состоит из кристаллического ядра [Au]m, на поверхности которого адсорбированы ионы AuCl4-, определяющие отрицательный заряд частицы. В зависимости от методики синтеза и состава реакционной среды на поверхности могут присутствовать и другие анионы. Ионы AuCl4- составляют внутренний слой двойного ионного (электрического) слоя и определяют величину потенциала адсорбции (поверхностный потенциал составляет около –50 мВ). Ионы H+ локализованы в интермицеллярном растворе (одна часть располагается в адсорбционной области, а другая – в диффузионной области двойного электрического слоя) [8]. Так происходит формирование двойной ионной оболочки вокруг наночастиц, которая порождает силы отталкивания между ними. В результате описанных процессов коллоидное золото стабильно только в растворах с низкой ионной силой, так как добавление электролитов компенсирует избыточный заряд ионных оболочек и понижает энергетический барьер отталкивания, что приводит к контакту поверхностей и слипанию частиц [9]. Таким образом, для получения НЧ золота необходим стабилизатор, который может соединяться с НЧ и формировать слой вокруг отдельных НЧ, тем самым вызывая их стабилизацию.
Условно мицеллу золота может быть представлена следующим образом:
,
Где [Au]m – ядро мицеллы (m – число атомов золота, которое может меняться от нескольких сотен до миллионов), n – количество адсорбированных ионов AuCl4- (n≪ m), δ0 – толщина адсорбционного слоя, d – толщина диффузной части двойного электрического слоя.
По строению и использованию НЧ золота могут быть разделены на две большие группы. Первая включает в себя конъюгаты НЧ с молекулярными структурами, обладающими самыми разнообразными функциями и свойствами. Такие структуры используют, например, для адресной доставки и контролируемого высвобождения противораковых лекарственных средств, локальной гипертермии опухолей, а также для оптической визуализации и создания сенсоров.
Ко второй группе относятся полые НЧ с диэлектрическим или магнитным ядром и золотой оболочкой. Такие структуры применяют для инкапсуляции лекарственных препаратов. Размеры НЧ золота могут меняться от 20 до 500 нм, что позволяет легко оптимизировать их биораспределение в условиях пассивной адресной доставки. Главным достоинством таких многослойных частиц является их полифункциональность, которая реализуется за счет разделения функций ядра и оболочки [10].
Важным при использовании НЧ золота в области биомедицины являются хорошо разработанные способы синтеза, а также простота и надежность методов модификации их поверхности.
Синтез НЧ золота осуществляют с помощью двух основных методик – дисперсионной или конденсационной. Диспергирование, как правило, происходит за счет жесткого физического воздействия на металлическое золото, например, с использованием электрического тока высокого напряжения. В свою очередь при конденсационных методах НЧ восстановленного металла образуются из ионов соответствующих солей путем мягкого физического (радиолиз, воздействие ультразвуком и др.) или химического воздействия [11]. Основным недостатком дисперсионных методов является образование неоднородных по величине частиц. По этой причине конденсационные способы синтеза НЧ золота в настоящее время наиболее распространены.
Основные реакции, протекающие во время синтеза НЧ радиолизом (1-3) [20].

Конденсационный синтез НЧ Au0 основан на получении коллоидных частиц диаметром 5–20 нм из галогенидов золота, в частности из тетрахлороаурата водорода, образующегося при растворении золота в царской водке. В качестве химических восстановителей используют цитрат или боргидрид натрия, аскорбиновую или этилендиаминтетрауксусную кислоты, а также щелочной раствор перекиси водорода [10].
Для получения НЧ золота размерами 8–120 нм, которые преимущественно и используются для медицинских целей, наиболее распространен метод цитратного восстановления тетрахлороаурата водорода, разработанный для получения НЧ золота со средним диаметром 20 ± 1,5 нм. Крупные НЧ золота диаметром более 80 нм можно синтезировать конденсационным методом с использованием в качестве восстановителя изоаскорбиновой кислоты в присутствии защитного коллоида гуммиарабика [10].
Несмотря на широкий спектр различных физических и химических подходов для синтеза наночастиц и наноматериалов желаемой формы и размеров, многие из этих методов и процессов включают использование опасных химических веществ (восстановители, стабилизаторы и неорганические растворители)

. Многие исследования показали, что использование данных методов синтеза наночастиц может привести к потенциальному негативному воздействию наноматериалов на организм человека при вдыхании, попадании на кожу или при проглатывании, следовательно, делая эти методы экономически нецелесообразными и экологически вредными. В связи с этим, растет потребность в более эффективном, экономически осуществимом и экологически чистом процессе синтеза наночастиц и наноматериалов. В качестве способа минимизации вредного воздействия и обеспечения максимальной безопасности и устойчивости производства наночастиц и наноматериалов является перспективным использование методов «зеленой химией», в основе которых лежит восстановление ионов металлов природными веществами [12]. Одним из таких восстановителей может выступать биоразлагаемый и биосовместимый полимер – хитозан.
1.2 Хитозан как универсальная матрица для формирования наночастиц
Развитие наноиндустрии позволяет создавать новые материалы, в которых оптимальным образом будут сочетаться различные свойства, или совершенствовать уже существующие. Выбор как полимерной матрицы, так и типа НЧ при создании новых композиционных материалов зависит от конкретной цели применения конечного материала.
Огромная ниша, в которой сейчас используются наноматериалы, связана с созданием медицинских препаратов на основе НЧ золота как для наружного, так и для внутреннего применения, что было отмечено выше. Оптимальным полимером-стабилизатором для НЧ золота и НЧ других металлов, применяемых в биотехнологии, может выступать ХТЗ [13].
По своей структуре ХТЗ представляет собой линейный биополимер, состоящий из звеньев D-глюкозамина и N-ацетил-D-глюкозамина, связанных β-1,4-гликозидными связями (рис.1) [6,14]. Звено ХТЗ, представляющее собой β – D-глюкозу, может выполнять функцию не только стабилизатора НЧ, но и их восстановителя [13].

Рисунок 1 – Структурная формула хитозана

В основе получения ХТЗ лежит реакция отщепления от структурной единицы хитина (обнаружен в изобилии в раковинах ракообразных, таких как омары, креветки и крабы) - N-ацетил-D-глюкозамина ацетильной группы или реакция деацетилирования (ДА). Процесс ДА проводят обычно с помощью концентрированных щелочей при повышенных температурах. Наиболее распространено ДА растворами щелочей 30-50 %-ной концентраций, поскольку оно является более мягким [6,14]. Реакции деполимеризации и ДА хитина часто сопровождаются одновременным разрывом β-(1-4) - гликозидных и ацетамидных связей полимера. Таким образом, хитозан представляет собой полидисперсный по молекулярной массе полимер D-глюкозамина содержащий от 5 до 50 % ацетамидных групп и от 1 % групп, соединенных пептидной связью с аминокислотами белков и пептидов [15].
Растворимость хитозана, биоразлагаемость, реакционная способность и адсорбция многих субстратов зависят от количества протонированных аминогрупп в полимерной цепи, следовательно, от доли ацетилированных и неацетилированных звеньев D-глюкозамина. Аминогруппы (pKa от 6,2 до 7,0) полностью протонированы в кислотах с pKa менее 6,2, что делает хитозан растворимым в них, а полученный растворимый полисахарид заряжается положительно. ХТЗ нерастворим в воде, органических растворителях и растворим после перемешивания в таких кислотах, как уксусная, азотная, соляная, перхлорная и фосфорная. Таким образом ХТЗ представляет собой аминополисахарид, который в нейтральных и щелочных средах содержит свободные NH2-группы, а в кислых средах они протонированы – NH3+, что открывает возможности для ионного сшивания при взаимодействии с полианионами [13,16,17].
Катионный характер ХТЗ дает ему способность образовывать комплексы с различными полианионами. Так, например, благодаря катионному характеру ХТЗ имеет тенденцию связываться с отрицательно заряженными клеточными мембранами. Он связывается с окклюдином, перераспределяет F-актин, разрушает плазматическую мембрану и снижает трансэпителиальное электрическое сопротивление клеток, тем самым увеличивая трансцеллюлярную и параклеточную диффузию включенных лекарств. Данный факт делает ХТЗ перспективным для составления систем, таких как липосомы и наночастицы, в которых лекарственные средства будут инкапсулированы в полимерной мембране [18].
Из-за низкой токсичности, способности к биологическому разложению, чувствительности к pH и мукоадгезии (способность к прилипанию к слизистым оболочкам) ХТЗ, нанодисперсные системы на его основе, могут использоваться в качестве эффективных носителей для пероральной доставки множества лекарственных средств [18].
В свою очередь к недостаткам ХТЗ можно отнести его нерастворимость в воде при физиологическом значении рН (ХТЗ растворяется при рН < 6,2) и его плохие механические свойства по сравнению с синтетическими полимерами [13].
1.3 Формирование НЧ золота, стабилизированных ХТЗ
Прекурсором для получения НЧ золота, стабилизированных ХТЗ, является тетрахлороаурат (III) водорода (HAuCl4).
Khoa Dang Nguyen Vo c соавторами предложили схему взаимодействия ионов Au3+ с макромолекулами ХТЗ за счет образования ионной пары между протонированными аминогруппами ХТЗ и ионами AuCl4- :

Однако при введении HAuCl4 в водные растворы ХТЗ в зависимости от рН среды происходит частичный гидролиз ионов AuCl4- по схеме:
AuCl4- + x OH-→ AuCl(4-x)OHx + x Cl
При этом в литературе нет информации о влиянии конформационных переходов макромолекул ХТЗ, которые происходят при изменении рН среды, на размеры и форму НЧ Au, стабилизированных ХТЗ [13].
В работе Wu Yuanpeng [19] продемонстрирован двухэтапный метод синтеза и стабилизации наночастиц золота с помощью хитозана при низких температурах. На первом этапе хитозан растворяют в воде при помощи ультразвука, после чего смешивают с HAuCl4 и инкубировали при комнатной температуре в течение 6 ч. На втором этапе к полученной смеси добавляют уксусную кислоту и нагревают до 35 ºC и инкубируют в течение часа. Результаты оптической спектроскопии, рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии и рентгеновской дифракционной спектроскопии подтвердили наличие наночастиц Au. Термогравиметрический анализ показала, что количество хитозана в системе Au/хитозана было около. 54,2 мас.%.
В статье [20] опиcан синтез наночастиц золота стабилизированных хитозаном с использованием ионизирующего излучения. Изначально хитозан (158 кДа) растворяли в уксусной кислоте (5 × 10-2 моль дм-3) в течение 24 ч. После чего добавляли HAuCl4 (1 × 10-3 моль дм-3), затем дополнительно был добавлен изопропанол (0,2 моль дм-3). До того как образцы для облучения были дегазированны насыщением аргоны. Растворы были облучены при комнатной температуре