Молекулярная диагностика онкологических заболеваний

Введение

Онкологические заболевания - это сложные заболевания, возникающее в результате прогрессирующего накопления генетических аберраций и эпигенетических изменений, которые позволяют избежать нормального клеточного и экологического контроля. Неопластические клетки могут иметь многочисленные приобретенные генетические аномалии, включая анеуплоидию, хромосомные перегруппировки, амплификации, делеции, перегруппировки генов, потери гена или мутации с повышением функции.
Недавние исследования также подчеркнули важность эпигенетических изменений некоторых генов, которые приводят к инактивации их функций в некоторых раковых опухолях человека. Эти аберрации приводят к ненормальному поведению, свойственному всем неопластическим клеткам: нарушению регуляции роста, отсутствию контактного торможения, геномной нестабильности и склонности к метастазированию. Гены, пораженные мутациями при раке, могут быть разделены на два основных класса: гены, которые имеют усиление функции (активации) мутаций, которые известны как онкогены; и гены, у которых оба аллеля имеют потерю функции (инактивации) мутаций, которые известны как гены-супрессоры опухолей.
Было показано, что около 100 генов играют определенную роль в развитии или прогрессировании рака человека, некоторые из которых вовлечены в широкий спектр злокачественных опухолей, тогда как другие являются уникальными для конкретного типа. Злокачественные опухоли могут возникать вследствие аберрации различных комбинаций генов, которые, в свою очередь, могут быть мутированы, сверхэкспрессированы или удалены.
Порядок, в котором происходят эти события, также оказался важным. Например, при раке молочной железы было предложено, чтобы по крайней мере 10 различных изменений гена могли быть вовлечены в инициирование и прогрессирование болезни. Исследование рака толстой кишки показало, что канцерогенез данного заболевания является многоэтапным процессом, включающим активацию клеточных онкогенов, делецию нескольких хромосомных областей и потерю функции генов-супрессоров опухолей.
Технологические достижения в молекулярной биологии за последние 20-25 лет привели к резкому увеличению идентификации молекулярных процессов, участвующих в опухолевом генезе. За этот период молекулярная основа рака больше не хранит тайну, которую он однажды сделал. Вместе с тем ясно также, что накопленных знаний недостаточно, чтобы претендовать на полное понимание механизма развития рака. Этот том объединил ряд соответствующих методов, с помощью которых можно выявлять и анализировать генетические аномалии, возникающие при раке. Это, в свою очередь, приведет к появлению других путей исследования, таких как: как мутации влияют на функционирование, как регулируются эти гены и как они взаимодействуют друг с другом. Мутационный анализ онкогенов и генов-супрессоров опухолей может служить доказательством специфической связи между этими генами и типом опухоли. Эти гены могут быть изменены во время канцерогенеза с помощью различных механизмов, таких как точечные мутации, хромосомные транслокации, амплификация гена или делеция. Кроме того, эти гены могут быть проанализированы на разных уровнях - ДНК, РНК или экспрессированные белки.

Анализ ДНК.
Мутационный анализ может быть выполнен с использованием различных методов, и большинство из них выделены в этом томе. Усиление специфических областей ДНК или РНК (главы 5-8) с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) открыло бесконечные возможности, которые могут быть использованы для быстрого и эффективного обнаружения изменений, даже изменений одиночных нуклеотидов. Эти методы основаны на изменении электрофоретической подвижности, вызванной измененной одноцепочечной вторичной структурой (одноцепочечный конформационный полиморфизм), измененными скоростями диссоциации фрагментов ДНК (денатурирующий градиентный гель-электрофорез), или с помощью анализа расщепления РНКазы.
ПЦР может также использоваться для быстрого и количественного обнаружения хромосомных перестроек, таких как обычно наблюдаемые при лейкемии. ПЦР предназначена для специфической амплификации геномных фрагментов, которые обычно не являются смежными и, следовательно, являются уникальными для этого типа генной перегруппировки. Обычно для этого анализа обычно требуется превращение РНК в ДНК с обратной транскриптазой до стадии ПЦР. Однако в некоторых случаях геномную ДНК можно использовать для прямого усиления транслокационных точек разрыва. Разновидностью ПЦР является использование отпечатков ДНК для обнаружения генетических перестроек при раке. Праймеры часто представляют собой произвольные или повторяющиеся (например, ALU) последовательности, которые дают после электрофореза отпечаток ДНК, который может быть использован для обнаружения генетических аномалий

. Микросателлитные повторы встречаются на протяжении всего генома Молекулярной онкологической генетики 3 и могут использоваться как маркеры для генетических изменений, обычно для потери гетерозиготности, что укажет на то, что произошло делеция, которая перекрывает этот специфический маркер. Для специфических генов, вовлеченных в некоторые виды рака, мутационный анализ может быть выполнен с использованием анализа усечения белка.
Этот анализ включает идентификацию аномальных полипептидов, синтезированных in vitro из продуктов RT-PCR, и усеченные мутации обычно подтверждаются анализом последовательности.
Молекулярно-генетические исследования опухолей человека повысили наше понимание механистической взаимосвязи между хромосомными аномалиями и раком. В лейкозов и лимфом, для которых обстоятельно кариотипический анализ был возможен, специфических транслокаций и инверсий было выявлено, что в результате дерегулирования протоонкогенов или создание аберрантных генов, синтез. Аналогичным образом, некоторые саркомы (например, Юинг и синовиальной саркомы) отличаются специфической транслокации. Во многих случаях эти транслокации представляют собой только изменение хромосомы, присутствующие в опухолевых клетках, что согласуется с идеей, что подобные изменения играют важную роль в патогенезе этих новообразований. В отличие от вышеупомянутых злокачественных новообразований, в общей эпителиальных опухолей взрослых, таких, как рак легких и молочной железы рак, обычное кариотипирование оказалось нелегко.
Многие из этих солидных опухолей имеют низкий митотический индекс, ограничивая количество метафазные подходящий для детального анализа хромосом кольцевания. Кроме того, кариотипы эпителиальные опухоли бывают очень сложными, с множеством дополнительных хромосом и комплекс маркеров, затрудняя усилия по выявлению сегментов хромосом, которые постоянно потеряли или приобрели. Хотя другие приемы разрешения обнаружения аллельные потери, мутаций, амплификации или ДНК, такие методы очень сосредоточены на том, что они ориентированы на один конкретный ген или хромосома области в то время, когда большинство генома без рассмотрения. Эти ограничения можно обойти с помощью молекулярно-цитогенетический подход называют сравнительной геномной гибридизации анализ.
Этот бесценный методика позволяет оценки геномного дисбаланса (прибыль, убытки, и ДНК амплификации) в пределах всего генома опухоли в одном эксперименте. Процедура СГГ включает в себя конкурентоспособными в гибридизации situ дифференциально меченных ДНК опухолевых и нормальных ссылок ДНК в нормальных человеческих метафазные. Что более важно, этот метод не требует опухолевых клеток, находящихся в митозе, так что архивных, а также свежие образцы могут быть исследованы. Кроме того, только небольшое количество геномной ДНК для анализа значимыми. Кроме того, для всех хромосомных сегментов в опухоли геном клетки, в том числе присутствующих в маркерные хромосомы, происхождение которых невозможно определить с помощью обычных кариотипирование.
ДНК добавляется к блоку повсеместно повторяющихся последовательностей. Гибридизация разрешено проходить в течение нескольких дней, с последующей промывкой для удаления несвязавшегося зонда. За реакцией наблюдали с помощью люминесцентного микроскопа оснащена охлаждаемым прибором с зарядовой связью камеры управляет компьютер станции. Это программное обеспечение также выполняет норматив вычисления и усреднения профиля для выявления геномного дисбаланса. Cgh-анализа 47 диспропорций в широком спектре опухолей человека, особенно распространенных эпителиальных опухолей. В последнее десятилетие, анализ СGH более 2200 твердые опухоли образцов, включающих 27 разных типов опухолей, не поступало.

Анализ экспрессии РНК
Технология микрочипов ДНК, в которой используются массивы двумерных олигонуклеотидных зондов высокой плотности с сотнями или тысячами олигонуклеотидных зондов, представляет собой мощный новый инструмент анализа последовательности ДНК для проверки на наличие множества генетических мутаций. Гибридизация к кДНК-микромассивам позволяет проводить одновременный параллельный анализ тысяч генов. Высокопроизводительное профилирование экспрессии генов становится все более ценным методом идентификации генов, дифференциально экспрессируемых в опухолях и нормальных тканях.
Микроэлементы с экспрессией гена очень перспективны для исследований опухолевого генеза человека, и полученные наборы данных о генерации большого гена могут дать новые идеи в фундаментальной биологии рака на молекулярном уровне