Механизмы ядерного импорта и экспорта. Ядерный локализованный сигнал. Роль импортина

Введение
Эукариотическое устройство клеток и организация ядерного материала позволило разграничить процессы репликации ДНК и транскрипции иРНК, протекающих в ядре от трансляции и удлинения полипептидной цепи, происходящих в цитоплазме, что в процессе эволюционного развития дает эукариотам возможности для более тонкой регуляции этих процессов.
Важной составляющей взаимодействия макромолекул между ядром и цитоплазмой осуществляется при помощи особого устройства – ядерной поры и ее компонентов.
Несмотря на достижения в биологических исследованиях, не все вопросы, касающиеся этих структур, изучены полностью. Некоторые ученые считают, что по значимости функций и сложности строения комплекс ядерных пор можно отнести к органеллам клеток.
Комплекс ядерных пор обеспечивает селективный транспорт через ядерную оболочку и играет решающую роль в некоторых дополнительных клеточных функциях. У высших эукариот ядерные поры и ядерная оболочка разбираются и повторно собираются во время деления клеток. Данный процесс пока также недостаточно изучен и нуждается в более детальной проработке. В настоящее время в науке визуализация живых клеток является мощным инструментом для анализа этих динамических процессов.
У всех организмов (человека, птиц, рептилий и других животных) во всех клетках эти структуры устроены аналогичным образом, то есть поровые комплексы являются строго консервативной системой. Компоненты ядерных комплексов имеют субъединичное строение, благодаря которому они обладают высокой пластичностью. Диаметр центрального канала варьируется в пределах 10-26 нм, а высота порового комплекса – порядка 75 нм.
Цель работы: изучить строение ядерных пор, механизмы ядерного импорта и экспорта, определить значение и функционал ядерного локализованного сигнала и роль импортина согласно современным исследовательским воззрениям.
ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ
Строение ядерной мембраны и ядерных пор
Ядерная мембрана в целом универсального строения и состоит из двойного слоя фосфолипидных молекул, формируя наружный и внутренний слои, удаленные друг от друга на 30 нм (рис.1)

Рисунок 1 – Электронная фотография ядерной мембраны и схема ее строения
Ядерная мембрана обладает более мощными механизмами избирательной проницаемости чем плазмалемма. Это достигается связями и взаимодействиями наружного слоя с сетью эндоплазматического ретикулума, а внутреннего слоя – с сетью промежуточных филаментов, сформированных белком ламином. Последняя структура называется ядерной пластинкой, служащей местом прикрепления хромосом [2].
Комплексы ядерных пор (nucleos porine complex – NPC) являются воротами, связывающими нуклеоплазму и цитоплазму. Эти структуры состоят из более 30 различных белков и массой 60–125 МДа в зависимости от вида. NPC являются двусторонними путями, которые избирательно контролируют прохождение макромолекул в и из ядра. Молекулы меньше 40 кДа пассивно диффундирует через NPC, в то время как более крупные молекулы требуют облегченного транспорта, обеспечиваемого их присоединением к кариоферинам. Белки-рецепторы семейства кариоферинов, формируя функциональный комплекс с транспортируемым белком, взаимодействуют с белками комплекса ядерной поры [7].
Кинетические исследования показали, что примерно 1000 транслокаций происходит в секунду на NPC. Сохранение его высокой селективности при одновременном быстром перемещении делает NPC эффективной химической наномашиной [2]. 
Транспортные пути между цитоплазмой и ядром регулируются на уровне экспрессии или модификации свойств отдельного груза, транспортного рецептора или же отдельных белков комплекса ядерной поры. Эти уровни регуляции иерархически организованы по степени избирательности воздействия и используются при модуляции различных процессов, от экспрессии отдельных генов до дифференцировки.
NPC представляют собой крупные (~ 30 МДа у дрожжей и ~ 60 МДа у позвоночных) структуры, которые охватывают двойную мембрану, окружающую ядро, и обеспечивают транспортный канал между ядром и цитоплазмой. NPC состоят из белков, называемых нуклеопоринами. Крупные транспортируемые молекулы (грузы) массой более 40 кДа), такие как белки и РНК, требуют участия растворимых транспортных рецепторов [4].
Много различных исследований привели к модели для структуры NPC (рис. 2).
Рисунок 2 – Модель порового комплекса
Ядро NPC состоит из цилиндра с восьмикратной симметрией вращения, который пронизывает ядерную оболочку и окружает центральный канал в форме песочных часов. В дополнение к этому центральному каналу существуют филаменты, которые простираются в цитоплазму, и структура корзины, которая простирается в нуклеоплазму. Грузы, которые движутся через ядерные поры, вероятно, сначала взаимодействуют с периферийными структурами, проходят через центральный канал и затем выпускаются в их целевое отделение [3].
Ядерные поры как у дрожжей, так и у позвоночных состоят приблизительно из 30 различных белков (рис.3). NPC имеет довольно большой размер, потому что большинство компонентов пор присутствуют в 16–32 копиях. Многие из этих нуклеопоринов содержат характерную повторяющуюся последовательность повторов фенилаланинглицина (FG). Эти FG-повторные нуклеопорины выстилают центральный канал поры и обеспечивают канал для движения макромолекул через комплекс пор. Белки нуклеопорина или Nups, которые составляют ядерную пору, являются высоко консервативными.
Рисунок 3 – Схематическое изображение ядерной поры с цитоплазматической стороной вверху и ядерной корзиной внизу. Названия ядер, расположенных в каждой области ядерной поры, указаны. Слева от схемы приведены названия почкующихся дрожжевых белков, а соответствующие белки позвоночных указаны справа
В табл. 1 приведены основные функции ядерных белков поры.
Таблица 1 – Ядерные белки поры и их функции
Млекопитающие Почкующиеся дрожжи (S

. cerevisiae) Расположение в NPC Мотивы / домены Предсказанная функция
Nup50 / Npap60 Nup2 Ядерный FG Транспорт
Комплекс Nup62: Nup45, Nup54, Nup58, Nup62d Комплекс Nup1: Nsp1d, Nup49, Nup57 Симметричный FG, спиральная катушка Структура;
транспорт
Nup88 Nup82 Цитоплазма β-пропеллер, спиральная катушка Структура
Комплекс Nup93:
Nup35 / 53, Nup93, Nup155, Nup188, Nup205 Комплекс Nic96: Nic96, Nup53, Nup59, Nup157, Nup170, Nup188, Nup192 Симметричный β-пропеллер, α-соленоид, FG Структура;
транспорт
NUP98 Nup100, Nup116, Nup145N Симметричный FG, Nup98 раза Транспорт
Комплекс Nup107–160 : Аладин, Nup37, Nup43, Nup75 / 85, Nup96, Nup107, Nup133, Nup160, Sec13, Seh1 Комплекс Nup84 : Nup84, Nup85, Nup120, Nup133, Nup145C, Sec13, Seh1 Симметричный β-пропеллер, α-соленоид Строительные леса
Nup153 Nup1, Nup2, Nup60 Ядерный FG Структура;
транспорт
Nup214 Nup159 Цитоплазма β-пропеллер, спиральная катушка, FG Структура
Nup358 - Цитоплазма FG Структура;
транспорт
gp210 Pom152 Трансмембранный TMH Транспорт
Ndc1 Ndc1 Трансмембранный TMH Структура
NLP1 / CG1 Nup42 Цитоплазма FG Структура;
транспорт
POM121 - Трансмембранный TMH, FG Структура
RAE1 / Gle2 Gle2 Симметричный β-пропеллер Транспорт
Tpr
Mlp1, Mlp2 ядерной Биспиральным
Структура;
транспорт
- Pom34 Трансмембранный TMH Структура
Основным фактором того, от чего зависит количество ядерных пор, является активность обмена веществ в клетке (чем она выше, тем больше число канальцев). Их концентрация в толще мембраны может изменяться в несколько раз в различные периоды функционального состояния клеток. Первое увеличение числа пор происходит после деления – митоза (во время реконструкции ядер), а затем в период роста ДНК. У разных видов животных их количество отличается. Оно зависит также от места взятия образца. Так, в культуре тканей человека их насчитывается порядка 11 шт./мкм2, а в несозревшей яйцеклетке лягушки ксенопус – 51 шт./мкм2. В среднем их плотность варьирует в пределах 13-30 шт./мкм2. Распределение ядерных пор по поверхности оболочки является практически равномерным, но в местах сближения вещества хромосом с мембраной их концентрация резко уменьшается. У низших эукариотов под ядерной мембраной нет фибриллярной сети жесткой структуры, поэтому поры могут перемещаться вдоль ядерной оболочки, и их плотность на различных участках значительно варьирует [2; 3; 4; 7].
Механизмы ядерного импорта и экспорта.
NPC участвуют в управлении двунаправленным транспортом белков и субчастиц рибосом между ядром и цитоплазмой.  В процессе нуклеоцитоплазматического переноса вовлечено ограниченное количество молекулярных факторов и общих механизмов, а именно: (1) косвенная ассоциация грузов с ядерными порами через рецепторы в донорном компартменте, (2) прогрессия в пределах канала через динамические гидрофобные взаимодействия с FG-Nups, и (3) NTPase-управляемое ремоделирование транспортных комплексов в целевом компартменте. 
Транспорт солей, нуклеотидов, небольших молекул и компонентов, требующихся для синтеза ДНК и РНК, осуществляется через NPC путем пассивной диффузии (рис. 4).
Рисунок 4 – Транспорт молекул через ядерную мембрану
Функциональный диаметр водной среды NPC, который оценивается в 9-10 Нм, позволяет проводить неселективную пассивную диффузию малых молекул, таких как ионы и низкомолекулярные метаболиты. Маленькие молекулы могут свободно пересекать NPC в обоих направлениях в зависимости от градиента концентрации.
Для импорта в ядро крупных белков, размером крупнее 40–65 кДа, требуется участие транспортных рецепторов, которые чувствительны к сигналам, посылаемым транспортируемыми белками. NPC задействованы также в восстановлении (репарации) ДНК, клеточном цикле, организации хроматина, регуляции транскрипции, процессинга (созревание) иРНК. 
Эукариотические транскрипционные факторы синтезируются в цитоплазме, но функционируют в ядре, чтобы регулировать экспрессию генов. Это создает логистическую проблему для этих белков, так как они должны быть импортированы в ядро для выполнения функции. Растворимые транспортные рецепторы семейства кариоферинов распознают в структуре белков специфические аминокислотные последовательности, короткие отрезки положительно заряженных последовательностей на белках-грузах, к которым относятся сигнал ядерной локализации (NLS) и сигнал ядерного экспорта (NES). Распознав нужный участок (типичным признаком NLS является повторение нескольких положительно заряженных аминокислот – лизин, аргинин), транспортные рецепторы либо связываются с ним напрямую, либо с помощью адапторных молекул, в результате чего запускается процесс транслокационных изменений.
Рисунок 5 – Схематичное представление механизмов ядерно-цитоплазматического импорта и экспорта
Рецепторы ядерного транспорта, постоянно перемещающиеся между ядром и цитоплазмой, в большинстве своем относятся к семейству β-кариоферина, каждый представитель которого «узнает» специфичную для него группу белков или РНК.
Характерным признаком членов данного семейства рецепторных белков является наличие многоповторных HEAT-мотивов, сформированных двумя антипараллельными амфифильными спиралями, соединенными линкерной областью. Именно эти структуры ответственны за узнавание транспортируемых белков, опосредованное ГТФазой Ran, а также за высвобождение белков после переноса. Таким образом, ГТФаза Ran и белок, который необходимо протащить через ядерную пору, связываются с суперспиралью рецептора изнутри, а нуклеопорины связываются с рецепторами через FG-мотивы снаружи, и таким образом, путем многократных последовательных связываний и разобщений NPC с рецептором белок транспортируется через пору