Конфокальный микроскоп - описание и история открытия

Введение
Конфокальный микроскоп создает четкие изображения образца, которые в противном случае выглядят размытыми при просмотре с помощью обычного микроскопа. Это достигается за счет исключения большей части света из образца, который не из фокальной плоскости микроскопа. Изображение имеет меньшую мутность и лучшую контрастность, чем у обычного микроскопа, и представляет собой тонкое поперечное сечение образца. Таким образом, помимо лучшего наблюдения за мелкими деталями, можно построить трехмерные (3D) реконструкции объема образца путем сборки ряда тонких срезов, взятых вдоль вертикальной оси.
История открытия
Конфокальная микроскопия была впервые введена Марвином Минским в 1955 году, когда он был младшим научным сотрудником в Гарвардском университете [1]. Изобретение Мински должно было выполнять построчное построение изображения, фокусируя точку света последовательно на образце и затем собирая часть возвращающихся лучей. Освещая одну точку за раз, Минский избегал большей части нежелательного рассеянного света, который затемняет изображение, когда весь образец освещается одновременно. Кроме того, свет, возвращающийся из образца, будет проходить через второе отверстие-обскуру, которое будет отклонять лучи, которые не были непосредственно от фокальной точки. Оставшиеся «желательные» световые лучи затем собирались с помощью фотоумножителя, и изображение постепенно восстанавливалось с использованием долговременного экрана. Чтобы построить изображение, Мински сканировал образец, перемещая сцену, а не лучи света. Это было сделано для того, чтобы избежать попыток сохранить чувствительное выравнивание движущейся оптики. Используя 60 Гц соленоид для перемещения платформы по вертикали и низкочастотный соленоид для его перемещения по горизонтали, Мински удалось получить частоту кадров примерно одно изображение каждые 10 секунд.
Современная конфокальная микроскопия
Современные конфокальные микроскопы сохранили ключевые элементы дизайна Минского: отверстия с точечным отверстием и точечное освещение образца. Достижения в области оптики и электроники были включены в современные разработки и обеспечивают улучшения в скорости, качестве изображения и хранении сгенерированных изображений. Несмотря на то, что существует ряд различных конструкций конфокальных микроскопов, в этой статье будет обсуждаться один общий тип - другие конструкции не отличаются заметно [2]. Большинство конфокальных микроскопов получают изображение либо путем отражения света от образца, либо путем стимулирования флуоресценции от красителей (флуорофоров), нанесенных на образец. Основное внимание в этой статье будет уделено флуоресцентной конфокальной микроскопии, поскольку именно этот режим наиболее часто используется в биологических приложениях. Разница между этими двумя методами невелика. Существуют методы, которые включают передачу света через образец, но они встречаются гораздо реже [3].
Флуоресценция
Если свет падает на молекулу, он может поглощать свет и затем излучать свет другого цвета, процесс, известный как флуоресценция. При обычных температурах большинство молекул находятся в их низшем энергетическом состоянии, основном состоянии. Однако они могут поглощать фотон света (например, синий свет), который увеличивает их энергию, заставляя электрон переходить в дискретное возбужденное синглетное состояние [4]. На рис. 1 представлена верхняя черная линия. Как правило, молекула быстро (в течение 10-8 секунд) рассеивает часть поглощенной энергии в результате столкновений с окружающими молекулами, в результате чего электрон падает до более низкого энергетического уровня (вторая черная линия). Если окружающие молекулы не способны принять большую разность энергий, необходимую для дальнейшего понижения молекулы до ее основного состояния, она может подвергаться спонтанному излучению, теряя тем самым оставшуюся энергию, излучая свет с большей длиной волны (например, зеленый свет) [5]. Флуоресцеин - это обычный флуорофор, который действует таким образом, испуская зеленый свет, когда стимулируется синим светом возбуждения. Длина волны возбуждающего света и цвет излучаемого света зависят от материала.
Рисунок 1 - Механизм флуоресценции. Горизонтальные линии показывают квантовые энергетические уровни молекулы. Молекула флуоресцентного красителя поднимается до возбужденного энергетического состояния с помощью высокоэнергетического фотона. Он теряет немного энергии для других молекул и падает до более низкого возбужденного состояния. Он теряет остальную энергию, испуская свет более низкой энергии.
Микроскопия в режиме флуоресценции имеет несколько преимуществ по сравнению с отраженным или проходящим режимами. Это может быть более чувствительным. Часто возможно прикрепить флуоресцентные молекулы к определенным частям образца, что делает их единственными видимыми в микроскопе, а также возможно использование более одного типа флуорофора [6]. Таким образом, переключая свет возбуждения, можно различить разные части образца.
Флуоресцентная микроскопия
В обычной флуоресцентной микроскопии окрашенный образец освещается светом соответствующей длины волны, и из полученного флуоресцентного света формируется изображение. На рисунке 2 свет возбуждения синий, а излучаемый свет - зеленый. Микроскоп использует дихроичное зеркало (также называемое «дихроматическим зеркалом»), которое отражает свет короче определенной длины волны, но пропускает свет большей длины волны. Таким образом, свет от основного источника отражается и проходит через объектив к образцу, в то время как более длинноволновый свет от флуоресцентного образца проходит как через объектив, так и в дихроичное зеркало

. Этот конкретный тип флуоресцентной микроскопии, в котором объектив, используемый освещающим светом, также используется флуоресцентным светом в сочетании с дихроичным зеркалом, называется эпифлуоресценцией. В случае микроскопии отраженного света вместо дихроичного зеркала используется светоделитель.
Рисунок 2 – Базовая настройка флуоресцентного микроскопа. Свет от источника отражается от дихроичного зеркала к образцу. Возвращающаяся флуоресценция с большей длиной волны может проходить через дихроичное зеркало к окуляру
Конфокальная микроскопия
Чтобы понять конфокальную микроскопию, полезно представить пару линз, которые фокусируют свет от фокуса одной линзы к фокусу другой. Это иллюстрируется темно-синими лучами на рисунке 3. Голубые лучи представляют свет из другой точки образца, которая не находится в фокусе левой линзы. (Обратите внимание, что цвета лучей приведены исключительно для целей различения двух наборов - они не представляют разные длины волн света.) Очевидно, что изображение светло-голубой точки не находится в том же месте, что и изображение темно-синего цвета. точка. (Вспомните из вводной оптики, что для формирования изображения система линз не обязательно должна находиться в фокусе объектива).
Рисунок 3 – Через отверстие проходит только свет от фокальной плоскости, остальной свет отсекается
В конфокальной микроскопии цель состоит в том, чтобы видеть только изображение темно-синей точки [1]. Соответственно, если экран с точечным отверстием расположен на другой стороне системы линз, тогда весь свет от темной точки будет проходить через точечное отверстие. A Обратите внимание, что в месте расположения экрана голубая точка выходит за пределы фокус. Кроме того, большая часть света блокируется экраном, в результате чего изображение светло-голубой точки значительно ослабляется по сравнению с изображением темно-синей точки.
Для дальнейшего уменьшения количества света, излучаемого точками «светло-синего цвета», установка конфокального микроскопа минимизирует количество освещаемого образца. Обычно при флуоресцентной микроскопии все поле зрения образца полностью освещается, что делает флуоресценцию всей области одновременно. Конечно, самая высокая интенсивность света возбуждения находится в фокусе линзы, но другие части образца действительно получают часть этого света, и они действительно флуоресцируют. Таким образом, свет в «синей» точке может включать в себя свет, рассеянный от других «светло-синих» точек, тем самым скрывая его флуоресценцию. Чтобы уменьшить этот эффект, конфокальный микроскоп фокусирует точку света в темно-синей точке, находящейся в фокусе, путем визуализации апертуры отверстия, расположенной перед источником света. [1] Таким образом, единственные области, которые освещены, являются конусом света выше и ниже фокальной (синей) точки.
Вместе два точечных отверстия конфокального микроскопа значительно уменьшают помутнение фона, типичное для обычного флуоресцентного изображения. Поскольку фокусная линза объектива формирует изображение, в котором находится точечное отверстие / экран, эти две точки известны как «сопряженные точки» (или, альтернативно, плоскость образца и точечная точка / экран являются сопряженными плоскостями). Маленькое отверстие в экране сопряжено с фокусной точкой линзы, отсюда и название «конфокальная».
Принцип работы конфокального микроскопа
Конфокальный микроскоп объединяет идеи точечного освещения образца и отклонения расфокусированного света. Недостаток изображения точки на образце состоит в том, что в любой момент времени требуется меньше испускаемых фотонов. Таким образом, чтобы избежать создания шумного изображения, каждая точка должна быть освещена в течение длительного времени, чтобы собрать достаточно света для точного измерения [1]. В свою очередь, это увеличивает продолжительность времени, необходимого для создания точечного изображения. Решение состоит в том, чтобы использовать источник света очень высокой интенсивности, что Минский сделал с циркониевой дуговой лампой. Современный выбор - это лазерный источник света, который имеет дополнительное преимущество в том, что он доступен в широком диапазоне длин волн.
На рис. 4 лазер излучает интенсивный синий свет возбуждения. Свет отражается от дихроичного зеркала, которое направляет его на сборку вертикально и горизонтально сканирующих зеркал. Эти моторные зеркала сканируют лазер через образец. Напомним, что изобретение Минского позволило сохранить оптику неподвижной, а вместо этого сканировало образец, перемещая сцену взад-вперед в вертикальном и горизонтальном направлениях. Как бы неловко (и медленно) ни казался этот метод, он имеет, среди прочего, следующие два основных преимущества [7]:
- Образец везде освещается в осевом направлении, а не под разными углами, как в случае конфигурации сканирующего зеркала, что позволяет избежать оптических аберраций. Таким образом, все поле зрения освещается равномерно.
- Поле зрения может быть сделано больше, чем у статического объектива, контролируя амплитуду движений сцены.
На рис. 4 краситель в образце возбуждается лазерным светом и флуоресцирует. Флуоресцентный (зеленый) свет отбрасывается теми же зеркалами, которые используются для сканирования света возбуждения (синего) от лазера, а затем проходит через дихроичное зеркало