Характеристика пивоваренных дрожжей

Введение

Saccharomyces cerevisiae (пивоваренные дрожжи) – это универсальные источники для производства продуктов питания и напитков различных видов в пищевой отрасли, лекарственных препаратов в фармацевтической отрасли, также используются в биотехнологии. Многие считают, что дрожжи самые полезные организмы, поскольку их использование человеком насчитывает несколько тысячелетий. В настоящие время, определено более 1,5 тыс. видов. Среди них есть как способные к спиртовому брожению, так и не неспособные, как полностью одноклеточные, так и образующие мицелий. Изучением занимались и занимаются многие авторы, к примеру И. П. Бабьева в 1950 году начала цикл исследования дрожжей.
Цель работы – изучение характеристики пивоваренных дрожжей.
В задачи работы входит:
сбор и анализ литературы по данной тематике исследования;
краткий анализ истории и систематики основных видов дрожжей;
характеристика пивоваренных дрожжей;
рассмотреть основные элементы технологии производства.

1. ИСТОРИЯ ОТКРЫТИЯ И СОЗДАНИЕ КЛАССИФИКАЦИИ ВИДОВ
1.1. История изучения
«Saccharomyces» (дрожжи) одни из первых микроорганизмов, которые люди научились применять с целью удовлетворения личных необходимостей. Главное их качество, которое наиболее привлекательное для человека, – это способность к образованию наибольшего количества спирта из сахаров. Саму историю использования данных микроорганизмов, принято условно разделять на три периода.
I-й или же донаучный период, это начало использования «Saccharomyces», не зная об их наличии. Во временном отрезке, дотируется около 6000 лет до н.э. В это время, человек также создавал разнообразные напитки включающие спирт. Например, продукт, сходствующий на нынешнее пиво – буза, который был популярен уже в Древнем Египте. Приготовление этого напитка, возможно, рассматривать рождением нынешнего пивоварения. Пути распространения методики пивоварения отражены на следующем рисунке 1.1.1 [3]:

Рисунок 1.1.1 Пути распространения технологии пивоварения.
Это подтверждают археологические находки при раскопках храма и гробниц фараона Эхнатона и его супруги, легендарной Нефертити, проживавших во 2-ой половине XIV в. до н. э., где были найдены формы для выпечки хлеба и кувшинов для пивоварения, рассмотренные на рисунке 1.1.2.


Рисунок 1.1.2 Наскальные изображения употребления пива.
В Китае популярность бродильных напитков начиналась с X в. до н. э., в это время они уже умели приготовлять на дрожжевой основе крепкие спиртные напитки. Европейские страны занялись пивоварением в 13 веке. Завершением данного этапа, возможно, рассматривать первичное представление дрожжей, какие в 1680 г. заметил в капле бродящего пива, под микроскопом, голландец Антони Ван Левенгук. Но эти микроорганизмы не привязывали к процессу создания пива, а сделанные им зарисовки и в наше время отражают верность отображения дрожжевой клетки. И только спустя 150 лет возникают новые учения о дрожжах [4].
II-ой период начинается с 19-го века, а точнее с 1830 года. К данному периоду относятся основные научные труды о дрожжах – это работы Каньяр де Латур во Франции, Теодор Шванн и Фридрих Кютцинг в Германии, в которых рассматривались способы размножения, спорообразования, а также жизненный цикл. Saccharomyces были описаны в 1837 г. Мейеном, он и дал им соответствующие наименование. Самое важное событием 2-го периода является исследования Луи Пастером самого процесса спиртового брожения, он изучал его на протяжении 16 лет (с 1860 по 1876 гг.), и тем самым доказав биохимическую природу процесса. Следом, в 1881 году Эмилем Хансен из Дании, выделяет впервые чистые культуры дрожжей. И благодаря этому открытию, технологии пивоварения, да и не только, также и виноделия, выходят на новый уровень – промышленный, став частью данного направления индустрии. Дальнейшие работы братьев Бюхнер из Германии (конец 19-го века) по процессу сбраживанию сахара бесклеточными экстрактами дрожжей, способствовали научному обоснованию процессов пивоварения. Также, нельзя не отметить, Э. Хансеном и А. Клекером из Дании, им принадлежит создание первичной научно-обоснованной классификации дрожжей [4].
Промышленная отрасль начинается с 1860 г. – построен специализированный дрожжевой завод (Вена). Их продукция составляла около 10-14 %, в перерасчете на зерно, при этом выход спирта составлял почти 30 %. Труд 1878 года Луи Пастера, о действии кислорода на жизненную деятельность дрожжей, стало началом развития аэробной технологии производства, с значительным выходом до 35 %, при этом получали около 12-13 л. спирта из 1 ц сырья. Отметим, то что в России дрожжевые заводы были созданы в 1862 году – городе Курске, затем в Москве – 1870 год, и в Петербурге – 1873 год. В них ходили: специализированные «дрожжевые заведения», дрожжи-винокуренные заводы, а также заведения по формированию прессованных дрожжей [4].
III-ий период начинается с 20-го века, при этом он характеризуется дифференциацией научных работ в сфере исследования дрожжей. В это время, организовывается эволюционно-филогенетическое направление в систематике дрожжей А. Гийермоном из Франции, создается первичная коллекция дрожжевых культур А. Клюйвером из Голландии.
Промышленность дрожжей в это время находится на высоком уровне. При этом происходит модернизация заводов на новый вид сырья – мелласа (кормовая патока) в 1914-1916 годах. Динамика производства пивоваренных дрожжей в России с 1914 по настоящие время представлена на рисунке 1.1.3


Рисунок 1.1.3 Динамика производства пивоваренных дрожжей в РФ (1914-2016 гг.).
Наибольший показатель отмечается в 1972 г. – 332 тыс. т/г., после этого, произошел спад их производства, в наше время он составляет – 154 тыс. т/г.
В 1954 г. опубликовался первый отечественный определитель дрожжей В.И. Кудрявцева. В наше время, научные открытия о дрожжах, хоть и располагают широкой информацией, но до сих пор делают все более новые и разные открытия, а также получения новейших любопытных данных из прошлого. Как пример, биолог Джавьер Карваджалом Баррига из университета в Кито (Эквадор), нашел в глиняном кувшине, который использовался для хранения напитка, датируемый 1200 годом до н.э. Он смог возвратить найденные древние дрожжи к жизни в лаборатории, и активировать их метаболизм с помощью увлажнения и регенерации поврежденных мембран. В процессе исследования профессор подчеркнул ряд видов дрожжей, ни один из каковых не употребляется для ферментации алкоголя в наши дни. Однако их отнесли к виду Candida. Подведя итоги, можно сказать что наука, занимающая изучением дрожжей, проделав более чем полуторавековой путь, не прекращает усиленно прогрессировать в 21 в. [2].


1.2. Систематика дрожжей
Систематизация микроорганизмов Saccharomyces относительно длительный период складывалась вне зависимости от систематики мицелиальных видов грибов. Причина – применение для определения их классового принадлежности: физиологических и биохимических параметров.
До половины 20 века все одноклеточные грибы анализировались в качестве довольно изолированной таксономической группой аскомицетов. Такого мнения придерживался и В. И. Кудрявцев, автор российской классификации дрожжей (1.2.1), он предложил связать их всех в подчиненный порядок Unicellomycetales [10].

Рисунок 1.2.1 Классификация дрожжей по В. И. Кудрявцеву (1954 г.).
Изменения мнений о такой классификации произошли после открытия японского ученого И. Банно, он смог индуцировать половой цикл размножения у гетероталличных красных дрожжей Rhodotorula glutinis. В результате изученного их жизненного цикла, итоги удостоверяли об отношении к категории гетеро-базидиомицетам. Следовательно, не все дрожжи, относятся к одному порядку, а встречаются вовсе разные таксономические группы грибов как аскомицетов, так и базидиомицетов. В виду настоящего, многие ученые начали деятельно применять биохимические и цитологические показатели.
В данное время исследование разнообразности характеризуется активным формированием филогенетической систематики, какая ориентирована в реконструкцию определенных линий исторического формирования организмов. У предоставленных микроорганизмов она обосновывается при исследовании 2-ух участков рДНК длиной приблизительно 600 нуклеотидных пар: D1/D2 домена на 5'-конце гена, кодирование 26 S рРНК, и внутреннего транскрибируемого спейсерного региона (ITS), содержащего ген 5.8 S рРНК. При этом утверждение: что в результате консервативности предоставленных областей различия между ними прямо пропорциональны филогенетической дистанции, степени эволюционного родства. Секвенирование нуклеотидных цепей рДНК оказывается мощным инструментом для создания филогенетической классификации дрожжей, установления их места в совместной системе грибов. К данному моменту расшифрованы почти все нуклеотидные последовательности рРНК у наиболее изученных видов дрожжей, что позволяет создать филогенетические деревья их эволюции рРНК (рис 1.2.2). Как следствие, группировка дрожжей по данному методу, не совпадает в почти всех вариантах с группировкой по фенотипическим свойствам. Поэтому традиционность признаков: характеристики вегетативного размножения, конфигурация аскоспор, дееспособность к сбраживанию и ассимиляции сахаров, начали расцениваться как не подходящие к установлению филогенетического родства. Секвенирование рРНК (рДНК) теперь считается нужным при обрисовке новейших видов дрожжей [7].

Рисунок 1.2.2 – Схема фенологического дерева группы базидиомицетов.
Классифицирование дрожжей, отыскивание их области в едином порядке грибов продолжают стремительно совершенствоваться, и в данной сфере не сформировано устоявшихся, константных суждений

.
В современном мире, используют в систематизации дрожжей, определенные группы признаков, которые представлены на рисунке 1.2.3 [8].

Рисунок 1.2.3 – Набор признаков для выявления классификации дрожжей
Для раскрытия всех данных показателей имеются стандартные методы, описываемые в определителях либо специализированных руководствах.
2. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА
2.1 Строение
Дрожжи имеют несколько форм клеток, некоторые из них представленные на рисунке 2.1.1.

Рисунок 2.1.1 Конфигурация клеток. Примечание: 1 – яйцевидные; 2 – эллипсовидные; 3 – цилиндрические (палочковидные); 4 – шаровидные; 5 – лимонно-образные; 6 – дрожжи, размножающиеся делением и спорами.
Размер у разнообразных видов от 2 до 10 мкм в поперечнике и 2–20 мкм в длину. Сама клетка (рис. 2.1.2) формируется из клеточной стенки, под каковой локализуется цитоплазмическая (клеточная) мембрана, цитоплазма, ядро, вакуоль, и содержит включения гранул полифосфатов, и митохондрий [5].

Рисунок 2.1.2. Строение
В цитоплазму входят жировые капли, митохондрии, рибосомы и иные элементы. Клеточная стенка состоит из сложных углеводов, полисахаридов в комплексе с липидами и азотистыми соединениями. Оболочка содержит наружный и внутренний слой. В наружном слое осуществляется перенос питательных веществ против градиента концентрации эндо-ферментами и ферментами-переносчиками. Во внутреннем слое переведение в клетку всевозможных веществ и продуктов метаболизма, и удерживает осмотическое давление в самой клетке. Жизненный цикл типичного лабораторного штамма 5. cerevisiae приведен на рис. 2.1.3 [5].

Рисунок 2.1.3 Жизненный цикл Saccharomyces cerevisiae
2.2. Метаболизм
Систематично распознают 2 вида пивных дрожжей: верхового и низового брожения, а каждый из них охватывает огромное количество штаммов (приложение № 1), различающихся друг от друга по рядам свойств. Например, из морфологических – очень значительны размерные показатели клеток: форма и однородность, а также возможность к образованию псевдомицелья. А вот, из физиологических и биохимических качеств важнейшими считаются: бродильная, седиментирующая, флокуляционная способности. Эти характеристики часто модифицируются, следственно анализ дрожжей опирается на основные константные характеристики (таблица 2.2.1) [5].

Таблица 2.2.1 Важнейшие свойства пивоваренных дрожжей
№ п/п Показатель
1 Стабильное образование желаемых вкусо-ароматических продуктов метаболизма
2 Быстрое брожение Эффективное брожение (максимальное образование этилового спирта, минимальное образование биомассы дрожжей)
3 Устойчивость к ингибирующим факторам в пиве и сусле (осмотическое давление, токсичный эффект от накопившегося этилового спирта и С02)
4 Подходящие флокуляционные и седиментационные свойства в конце брожения (для «верховых» дрожжей — образование шапки)
5 Высокий уровень генетической стабильности при последующих ферментациях

Характеристики пивоваренных дрожжей, относящихся к классу аскомицетов, встречающихся при производстве пива представлены в приложении 2.
Сам процесс метаболизма связывает все ферментативные реакции, какие проходят в клетке, и включает организацию и регуляцию этих реакций. С биохимической точки зрения схема процесса представлена на рисунке 2.2.1.

Рисунок 2.2.1 Всеобщая модель метаболизма дрожжей
В результате гликолиза (путь Эмбдена-Мейргофа, Embden-Meyerhof) (рис. 2.2.2) из 1 моля глюкозы образуется 2 моля пировиноградной кислоты (пирувата). Затем 1 моль пирувата при участии пируват декарбоксилазы и алкогольдегидрогеназы реорганизуется в 1 моль этилового спирта и 1 моль диоксида углерода [7].

Рисунок 2.2.2 Путь Эмбдена-Мейергофа (гликолитический)
Биологическая задача этих 2-ух конечных реакций – окисление НАДН, образовавшегося ранее при участии глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, до никотин-амида-дениндинуклеотида (Н АД+), что позволяет продолжить перенос углерода и синтезировать аденозинтрифосфат (АТФ). Этот путь содержит равно как утилизацию, так и образование АТФ, подавая чистый прирост АТФ в 2 моля на каждый моль перерабатанной глюкозы. Это отражает поглощение только около 4% аккумулируемой в сахаре энергии. Такой неэффективный процесс спиртового брожения происходит до тех пор, пока концентрация сахара превышает 5 г/л; при более низких концентрациях глюкозы в присутствии кислорода S. cerevisiae метаболизм сахара путем более эффективного процесса митохондриального окислительного фосфорилирования, как правило используемого эукариотами. При окислительном фосфорилировании из пирувата образуется в основном ацетил-КоА, а не ацетальдегид. Далее метаболизм осуществляется в цикле трикарбоновых кислот (ЦТК) и цепи переноса электронов. В результате образуется около 30 моль АТФ на 1 моль глюкозы. Сахара полностью окисляются до в СО2 и Н2О, и представлено следующей реакцией (2.2.1) [5].
(2.2.1)
Гликолиз считается первоначальным шагом спиртовой ферментации. При этом, бродильная активность дрожжей основывается на двух свойствах: степенью и скоростью сбраживания углеводов сусла.
По критерию сбраживания низкомолекулярных (НМ) углеводов сусла дрожжи разделяют на три группы: низкие, среднее и высокие, обеспечивающие в соответствии наименее 80%, 80-90% и 90-100% степени сбраживания. Сам общий процесс брожения и их энергетический баланс, можно отразить следующей реакцией:

В результате, выход АТФ в пути составляет 2 молекулы на молекулу глюкозы. Результативность ферментации будет около 25-28 %; а 75-72 % энергии не сохраняется клеткой и в основном рассеивается в виде тепла, по этой причине необходимо использовать охлаждающие установки. Скорость брожения переменчива, и максимальная энергичность отмечается 1-ые 23–35 ч. Впоследствии по причине ингибирования клеток этанолом данный процесс замедляется. При этом в питательной среде необходимо присутствия тиамина (витамина В1) и ионов элементов: Mn+2, Co+2, Zn+2, Mg+2 [5].
2.3 Влияние внешних условий на жизнедеятельность дрожжей
Факторы влияния на жизнеспособность дрожжей представлено в таблице 2.3.1.
Таблица 2.3.1 – Влияние отдельных условий окружающей среды на физиологию S. cerevisiae.
Показатель Действие Влияние
1 2 3
О2
Позволяет синтезировать ненасыщенные жирные кислоты и эргостерин Устраняет фактор, лимитирующий рост клеток и их размножение

Индуцирование и подавление некоторых генов Не определено.
Глюкоза Активация и индукция цитоплазматической мембраны Н* АТФазы
Повышается способность поддержать активный транспорт нутриентов путем протонного насоса

Подавление генов НХТ-6 и 7 и индукция генов НХТ-1 и 3 Увеличение интенсивности и значения Км системы транспорта глюкозы

Стимуляция R4S-reHOB, повышение концентрации цАМФ, активности протеинкиназы А и уровня фосфорилирования белка Увеличение метаболической активности с переходом к гликолизу и расщеплению гликогена

Подавление SUC-генов Не действует на семенные дрожжи

Подавление MAL-генов и деградация белков транспортеров мальтозы Неспособность утилизировать мальтозу и мальтотриозу из сусла
продолжение таблицы 2.3.1
1 2 3

Подавление митохондриальных генов, регулирующих цикл ЦТК, перенос е-и окислительное фосфорилирование

Неполное развитие митохондрий и неспособность дышать даже в присутствии кислорода
Гиперос-мотический стресс Активация посредников обмена NaVH* в эндосомальном/ предвакуолярном отделе Перенос солей и воды через вакуоль в цитоплазму для обеспечения краткосрочной сопротивляемости

Стимулирование HOG-пути Повышение активности глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы; закрытие мембранных пор для глицерина и увеличение концентрации глицерина в цитоплазме для обеспечения долгосрочной сопротивляемости
Усваивае-мый азот Для аминокислот — выборочная систем поглощения Поддержание транспортных систем сахаров в клеточной мембране. Увеличение биосинтеза аминокислот, нуклеотидов и белка

Наилучшей для жизнедеятельности дрожжей является t=22–30 °С. С увеличением t до 30 °С интенсивность дыхания повышается, а уже при 40 °С заметно снижается. Оптимальное значение t, при интенсивном брожении проходит, около 35 °С. Встречаются термофильные штаммы дрожжей, которые способны сбраживать сусло и при большой t. Нагрев в течение 15 минут увеличивает t до 60 °С, что повергает сусло к пастеризации, а энергичная его ферментация прерывается при t 45 °С, объемное содержание спирта составляет около 10 %. Отмечается утрачивание клеток способности размножаться, и как следствие их гибель.
Многие виды S. cerevisiae хорошо развиваются при рН 4,0–5,5, данный показатель является лучшим для размножения. При снижении рН дрожжевые клетки могут немного изменяться в размере, так как в них увеличивается содержание жира [2].

3. ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ
3.1. Основные определяющие факторы
Физиологическое состояние дрожжей обусловливает флокуляционную способность дрожжей; скорость и степень сбраживания сусла (бродильную активность); синтез побочных продуктов брожения.
Флокуляция – это обратимая агрегация, или агглютинация дрожжевых клеток. С данным признаком объединены подобные характеристики, как степень сбраживания сусла, органолептические свойства пива, а также его биологическая и коллоидная стойкость. Верное прохождение процесса флокуляции показывается способностью проводить процесс фильтрования. Данная способность дозволяет безвредно для окружающей среды отъединить дрожжи от пива в финале ферментации