Глициновые рецепторные каналы: структура, функции, физиологическая роль.

Введение

Глицин (Gly) выполняет в организме целый ряд жизненно важных функций. Он входит в состав многих белков и биологически активных соединений, из него синтезируются порфириновые кольца гема и пуриновые основания. Данная аминокислота незаменима в регуляции нейромедиаторной синаптической трансмиссии в центральной и периферической нервной системе. Рецепторы к Gly, локализованные во многих участках головного и спинного мозга, оказывают тормозное воздействие на нейроны, уменьшая выделение возбуждающих аминокислот. В то же время глицин выступает в роли коагониста рецептора g-аминобутирата (GABA-R) и глутаматного рецептора NMDA-R. Несмотря на широкий спектр позитивных эффектов фармакологических препаратов на основе Gly (улучшение памяти и ассоциативных процессов, антидепрессивное действие, уменьшение чувства тревоги, страха, психоэмоционального напряжения и др.), многие механизмы реализации этих процессов далеки от ясности, а наиболее изученные звенья в большинстве случаев основаны на многочисленных гипотезах.
О влиянии Gly на жизнедеятельность клеток в культурах нервной ткани практически ничего не известно, поскольку большая часть данных литературы направлена на изучение биоэлектрической активности клеточных мембран под действием Gly в роли нейромедиатора. Однако недавно показано, что в присутствии Gly в диапазоне концентраций 0,01–25,0 мМ замедляется развитие дегенеративных изменений в клеточном пласте культур спинного мозга и глиомы С6, вызванных депривацией трофических факторов сыворотки крови. На протяжении всего времени наблюдения (72 ч) регистрировали снижение активности 2-кальпаина, лактатдегидрогеназы в клетках и кондиционированных средах этих культур, снижение гибели клеток, сохранение пролиферативной активности клеток в культурах нервной ткани.
Выживаемость клеток спинного мозга при добавлении Gly возрастала в 2–7 раз. В условиях продолжительной депривации сыворотки крови в культуральной среде 0,1 мМ Gly оказывал митогенный эффект на нервные клетки спинного мозга крысы (14 сут in vitro), что проявлялось в увеличении содержания в клетках ДНК и появлении в культурах юных нейронов. Установлено, что Gly критически влиял на характер воздействия плазминогена. Так, в концентрации 0,01 или 0,1 мМ он при совместном влиянии с плазминогеном (10–7 М) потенцировал протекторный эффект зимогена на клетки культур С6 и спинного мозга, а при уменьшении концентрации зимогена на порядок – усиливал стимулирующее влияние плазминогена на клетки глиомы С6. При этом, стабилизирующее действие проявлялось на морфо-функциональном и на метаболическом уровнях.
Обнаружение таких многочисленных эффектов Gly на нервную ткань in vitro свидетельствует об огромном значении данной аминокислоты для регуляции жизнедеятельности клеток нервной ткани (в частности, изменении клеточного цикла, защите клеток при действии повреждающих факторов, в принципиальном изменении характера воздействия на клетки белков с нейротрофическими свойствами типа плазминогена), детальное уяснение характера которых открывает перспективы многоплановых исследований.


1. Метаболизм глицина в организме и его функции

Глицин был обнаружен в составе белков около 200 лет назад, но исследования динамики его содержания в структурах мозга вызывают споры в научных кругах и по сей день. В головном мозге содержание Gly (также как и GABA) превалирует в порядке убывания в таких отделах как средний мозг, таламус, мозжечок, кора височной доли и мозолистое тело. Принято считать, что содержание свободного Gly в мозге человека в норме соответствует 1,3 мкМ, а в ликворе – на два порядка меньше. Поскольку потребление глицина в нервной ткани относительно велико, а поступление его из кровяного русла происходит медленно, значительная часть Gly синтезируется в мозге de novo Главными источниками Gly в ЦНС служат глюкоза и серин. Причём серин может образовываться из глюкозы через 3-фосфоглицерат, к тому же, он сравнительно быстро поступает из циркулирующей крови в мозг через гематоэнцефалический барьер. Синтез Gly de novo в нервной ткани из серина происходит при участии серингидроксиметилтрансферазы.
Высокая активность этого энзима обнаружена в метаболических пулах головного и спинного мозга, в частности в мозжечке и передних рогах спинного мозга. Активность серингидроксиметилтрансферазы коррелирует, в первую очередь, с содержанием глицина в данных структурах. Выделяют ещё два источника синтеза Gly в нервной системе человека и животных: глутамат и глиоксилат. Первый вносит больший вклад в образование Gly, поскольку по содержанию глутамат в мозге занимает первое место среди других аминокислот (порядка 10,6 мкМ), а количество глиоксилата незначительно. Из глии в нейроны поступает глутамин – предшественник возбуждающих (глутамата, аспартата) и тормозных (GABA и Gly) медиаторов. В нервной ткани существует по крайней мере три пути катаболизма Gly. Первый заключается в том, что реакция превращения серина в Gly легко обратима в ткани мозга, и серингидроксиметилтрансфераза может выступать в качестве энзима, метаболизирующего глицин. Второй путь сводится к использованию широко представленными в ЦНС оксидазами аминокислот Gly в качестве субстрата наряду с другими аминокислотами.
Третья система расщепления Gly локализована исключительно в митохондриях и является нетипичной декарбоксилазой аминокислот, так как зависит и от NAD+ , и от тетрагидрофолата (THF). При участии Gly-расщепляющей системы Gly распадается на метилентетрагидрофолат, диоксид углерода и аммиак, затем происходит окисление метилен-THF с образованием СО2 – окончательного продукта распада обозначенной аминокислоты. Gly-расщепляющие системы были обнаружены не только в нейрональных клетках, но и в астроцитах, что подтверждает распределение метаболических реакций в нервной ткани в соответствии с функциональными особенностями типов клеток. В состав митохондриальной Gly-расщепляющей системы головного мозга входят четыре компонента: белок P (пиридоксальфосфатзависимая декарбоксилаза глицина), белок T (THF-зависимая аминометилтрансфераза), белок H (содержащий липоевую кислоту белок переносчик протонов) и белок L (липоамиддегидрогеназа). С помощью анализа in situ гибридизации было показано, что мРНК белка P экспрессируется преимущественно глиоподобными клетками, включая Бергмановскую глию мозжечка, тогда как мРНК T- и H-белков регистрировали в нейронах и глиоподобных клетках. В спинном мозге экспрессировались мРНК только T- и H-белков, при этом астроциты первичной культуры спинного мозга содержали только переносчик протонов (белок H), не обладающий какой-либо энзиматической активностью. Важно отметить, что первичная астроцитарная культура коры головного мозга крыс имела более высокую активность митохондриальной Gly-расщепляющей системы нежели гепатоциты. Установлено также, что в спинном мозге и стволе головного мозга Gly выполняет функцию ингибиторного нейротрансмиттера, тогда как в гиппокампе, коре головного мозга, мозжечке и обонятельной луковице – роль возбуждающего модулятора глутаматного рецептора NMDA-R.
Анализ литературы позволяет предположить, что Gly-расщепляющая система участвует в патогенезе некетогенной гиперглицинемии именно через модуляцию NMDA-Rs в переднем мозге и мозжечке. Следовательно, метаболизм Gly включает в себя целый ряд ката- и анаболических процессов, пересекающихся в ряде точек, суммируя которые, можно представить схему метаболизма Gly. Это позволяет одним процессам превалировать над другими. Например, в астроцитах головного мозга крыс активность митохондриальной Gly-расщепляющей системы превышает таковую энзимов, катализирующих обратное превращение Gly в серин – вероятность расщепления Gly в астроцитах большая, чем образование из него серина. Спинной мозг наделён высокоаффинной и низкоаффинной системами захвата Gly, в то время как кора головного мозга содержит только низкоаффинную систему.
Принято считать, что роль Gly в головном мозгу заключается преимущественно в активации рецепторов глутамата, учитывая, что для активации NMDA-Rs требуются концентрации агониста порядка 0,0001–0,1 мМ

. В силу этого, следует ожидать, что роль низкоаффинной системы коры головного мозга, по-видимому, в такой ситуации в регуляции функции кортикальных клеток будет весьма невелика. Но нельзя забывать, судя по данным литературы, что концентрация Gly в головном мозгу оценена в пуле (в массе) ткани или коры мозга. Поэтому в конкретный промежуток времени и в конкретном сайте в физиологических условиях концентрация данной аминокислоты может быть вполне достаточной для включения регуляторной функции и низкоаффинной системы захвата Gly. Это отдельный вопрос, требующий проведения дальнейших исследований. Перенос нейромедиаторных аминокислот через гидрофобную часть мембран клеток нервной ткани обеспечивается специальными Na+ /Cl --зависимыми белками-транспортерами, которые распознают, связывают, а потом переносят нейромедиаторы из внеклеточного пространства в клетку или из неё.
Представители суперсемейства Na+ /Cl -- зависимых транспортеров нейромедиаторов являются мембранными белками III типа, пересекающими 12 раз плазматическую мембрану. По вторичной структуре это семейство подразделяется на два подсемейства: “классические” представители (переносчики GABA, Gly, b-аланина, пролина, дофамина, норадреналина, серотонина) и так называемые орфаны (переносимые ими нейромедиаторы пока не известны). Основные Gly-транспортеры (GLYT1, GLYT2) присутствуют и в нейронах и в астроглии. Так, например, GLYT1, локализующийся преимущественно в астроцитах, ассоциированных с глицинергическими (и не только) нейронами экспрессируется в шейном отделе спинного мозга и стволе головного мозга, а GLYT2, локализующийся преимущественно в аксонах, нейритах и соме глицинергических нейронов, был обнаружен, помимо спинного мозга и ствола головного мозга, в мозжечке и сетчатке глаза. Как показывают исследования, для продукции глиальными клетками GLYT1 необходимо присутствие нейронов, что подчеркивает существование кроссрегуляции обоих типов клеток при инициации и поддержания экспрессии данного транспортера в нервной ткани. Существует и деление Gly-транспортеров на подтипы. Два гена, glyt1 и glyt2, кодируют несколько изоформ переносчиков глицина: GLYT1a–c, e–f и GLYT2a–b. Переносчик-GLYT2а в Gly-ергических нервных окончаниях характеризуется стехиометрией 3Na+ /Cl -/Gly, соответственно которой прогнозируют эффективное накопление Gly при всех физиологических состояниях. Он осуществляет обратный захват аминокислоты нейроном из синаптической щели.
Переносчик в астроцитарной глии GLYT1b характеризуется стехиометрией 2Na+ /Cl -/Gly, предсказывающей экспорт (импорт) Gly в зависимости от физиологических состояний. Он может снижать концентрацию Gly в синапсах и модулировать глутаматергические потоки через NMDA-R. В исследовании A. Bradaïa и соавторов было показано, что ингибирование переносчиков Gly в нейронах и глиацитах спинного мозга крысы вело к увеличению продолжительности глицинергических синаптических потоков и как следствие – росту глутаматергических возбуждающих постсинаптических потоков. Существует отдельная группа транспортеров аминокислот, которые осуществляют транспорт медиаторов в нервных синапсах. По месту локализации и действия она разделяется на две подгруппы: подгруппа нейромедиаторных переносчиков, осуществляющих транспорт через плазматическую мембрану, и подгруппа нейромедиаторных транспортеров синаптических везикул. Последняя объединяет в себе GABA/Gly-транспортер (VIAAT/VGAT), транспортеры моноаминов и ацетилхолина.
Основная их функция заключается в аккумулировании нейромедиаторов с целью их последующего использования в синаптической передаче. Кроме того, поступление Gly в клетку, как предполагают, может обеспечиваться и за счёт обычной диффузии. Таким образом, как нервные, так и глиальные клетки содержат собственные специфические переносчики глицина, Gly-захватывающие и Gly-расщепляющие системы, позволяющие не только обеспечить скоординированный синтез необходимых субклеточных элементов, но и модулировать нейротрансмиттерные потоки. Ключевое звено такой регуляции обусловлено наличием специфических рецепторов к Gly в нервной ткани
2. Рецепторы глицина и сайты связывания

Поскольку аминоуксусная кислота является метаболитом широкого спектра действия в ЦНС и ПНС, в нервной ткани должны существовать, по меньшей мере, два вида рецепторных аппаратов, посредством которых активируются глутаматергические или глицинергические потоки. В настоящее время выделяют четыре типа рецепторов, с которыми может связываться Gly: собственный специфический рецептор глицина (Gly-R), ионотропный рецептор глутамата, селективно связывающий N-метил-D-аспартат (NMDA-R), и ионотропные рецепторы g-аминомасляной кислоты (GABAА-R, GABAС-R) (табл. 1).
Собственный глициновый рецептор и ионотропные GABA-рецепторы, находящиеся на постсинаптической мембране многих нейронов, входят в суперсемейство никотинового ацетилхолинового рецептора. Все рецепторы данной группы – это ионные каналы, состоящие обычно из пяти субъединиц. После связывания лигандов с GABA-R или Gly-R рецептор повышает уровень ионов хлора в клеткемишени, тем самым гиперполяризуя мембрану. Собственный глициновый рецептор – это белок с четвертичной структурой, состоящий из субъединиц двух типов: a и b. Было установлено следующее соотношение субъединиц: 4a:1b. Они гомологичны друг другу по последовательности аминокислот. Субъединицы соединены дисульфидными связями, образуя длинную молекулу, несколько раз проходящую сквозь мембрану клетки. Каждая субъединица Gly-R состоит из достаточно большого N-концевого глобулярного внеклеточного домена, находящегося в синаптической щели, четырёх трансмембранных частей, внутриклеточной петли и короткого внеклеточного С-конца. Между субъединицами (внутри одной из трансмембранных частей) находится ионный канал, обладающий избирательной проницаемостью по отношению к анионам – ионам Cl -, Br-, I- (в клетке это, в основном, Cl -) и иногда к бикарбонату
Исследования показали, что во взаимодействии с глицином играют роль и a-, и b-субъединицы, причём участки на их (–) концах связываются с карбоксигруппой глицина, а на (+) концах – с аминогруппой. Так как расстояние между участками связывания Gly-R с лигандом и той его частью, где находится ионный канал, невелико, то изменения конформации белка при соединении с глицином должны влиять на открытие канала. Точный механизм этого неизвестен, несмотря на то, что внеклеточный домен гомологичных рецепторов изучен хорошо. К настоящему времени у млекопитающих были обнаружены четыре гена, кодирующие различные a-субъединицы, и всего один ген, кодирующий b-субъединицы. Функция b-субъединиц – закрепление Gly-R в мембране, благодаря своей гидрофобной части. Видоизменение b-субъединиц (в пределах нормы) не влияет на активацию рецептора и его ответную реакцию. Механизмы, отвечающие за закрепление рецептора в мембране и его посттрансляционные модификации, недостаточно изучены.

Таблица 1: Экспрессия рецепторов глицина

Экспрессия генов a-субъединиц Gly-R зависит от топографии нейрона, а также неодинакова в разные периоды развития организма. Например, мРНК и белок a1 встречаются в спинном, головном мозге, в клетках-палочках сетчатки у взрослых особей, а уровень a2 максимален при рождении. У взрослых особей белок a2 встречается лишь в небольших количествах в гиппокампе, коре мозга и таламусе. Субъединицы b широко распространены в ЦНС млекопитающих до и после рождения. Глицин в ЦНС взрослых функционирует в основном, как тормозный нейромедиатор, тогда как у эмбрионов он является возбуждающим нейромедиатором. Такое действие возможно благодаря тому, что у эмбрионов концентрация Cl - в клетке выше, чем во внешней среде, поэтому Gly-R при открытии канала вызывает деполяризацию мембраны. Эта возбуждающая функция Gly-R важна для генезиса синапсов. На первых стадиях перинатального онтогенеза, благодаря работе K+ /Cl - транспортера, концентрация Cl - в клетке падает, и Gly-R выполняет уже гиперполяризующую функцию