Биокатализ

Введение

Актуальность работы. Биокатализ - одна из перспективных отраслей биотехнологии, широко используемая в промышленности, сельском хозяйстве, тонком органическом синтезе, медицинской диагностике и экологической практике. Для разработки лекарственных препаратов на основе ферментов используют углеродные сорбенты, которые могут проявлять как собственную каталитическую активность, так и служить носителями для иммобилизации ферментов. Эффективность углеродных биокатализаторов зависит от природы сорбента, его структурно-сорбционных свойств и химии поверхности. Знание этих особенностей необходимо для создания сорбентов направленной терапевтического действия, а также разработке биокатализаторов на основе ферментов, иммобилизованных на поверхности твердых тел, для биотехнологических процессов и потребностей биосенсорике.
Объект исследования: Биокатализ
Предмет исследования: процесс использования биологических систем для ускорения химических реакций.
Цель работы: рассмотреть основы биокатализа
Для осуществления поставленной цели необходимо решить задачи:
- рассмотреть биокатализ и его основы;
- описать промышленный биокатализ;
- проанализировать биокатализ в производстве лекарственных средств;
- выявить перспективы развития биокаталитических технологий
1 Биокатализ и его основы
Ферментативный катализ - это вид химического катализа, который происходит под действием природных макромолекул как в живой клетке, так и вне ее.
Первое исследование ферментативного катализа как химического процесса было проведено К. Кирхгоф, который в 1814 году продемонстрировал ферментативное превращение крахмала в растворимые углеводы. в конце xix века Э. Фишер выдвинул гипотезу о специфичности ферментативных реакций и тесном историческом соответствии между субстратом и активным центром фермента. Основы кинетики ферментативных реакций были заложены в работах Л. Михаэлиса (1913).
В ХХ веке происходит интенсивное изучение химических основ ферментативного катализа, получение ферментов в кристаллическом состоянии, изучение структуры белковых молекул и их активных центров, изучение большого числа специфических ферментативных реакций и ферментов.
В простейшем случае уравнение реакции с участием фермента имеет вид:
где e-фермент, s-субстрат, es-комплекс фермент-субстрат (t), p-продукт реакции. часто субстрат образует ковалентные связи с функциональными группами активного центра, в том числе и с коэнзимом. большое значение в механизмах ферментативных реакций имеет основной и кислотный катализ, который реализуется за счет присутствия имидазольных групп гистидиновых остатков и карбоксильных групп дикарбоновых аминокислот.
Важнейшими характеристиками биокатализа являются эффективность, специфичность и чувствительность к регуляторным воздействиям. Ферменты увеличивают скорость химического превращения субстрата по сравнению с неферментативной реакцией в 109-1012 раза. Так, если процесс под действием какого-либо фермента протекает в течение одной секунды, то такая же реакция под действием "классического" химического катализатора иона водорода займет 200 тысяч лет! Такая высокая эффективность обусловлена особенностями строения активного центра.
Большинство ферментов обладают высокой субстратной специфичностью, то есть способностью катализировать превращение только одного или нескольких сходных по структуре веществ. Специфичность определяется топографией активного участка, связывающего субстрат.
Ферментативные реакции чувствительны к внешним условиям, в частности к ионной силе раствора и рН среды, температуре, и регулируются многочисленными ингибиторами и активаторами, присутствующими в организме. Ингибиторами и активаторами могут быть сами субстраты, продукты реакции, а также конечные продукты в цепи последовательных превращений вещества. Фундаментальные исследования и практические работы последних десятилетий привели к тому, что ферменты стали наиболее распространенными, наиболее доступными и наиболее изученными катализаторами, обеспечивающими развитие многих областей химии, медицины, экологии, возобновляемой энергетики.
Преимущества биокатализа обусловлены уникальными свойствами ферментов, используемых в качестве биокатализаторов для различных превращений. В отличие от традиционных катализаторов, используемых в химии, биокатализаторы способны работать в мягких условиях (низкие температуры, нейтральная водная среда) с высокой специфичностью, а также выполнять стерео - и регионоспецифические реакции. Практика промышленного применения показала, что в целом биокаталитические процессы экологически безопаснее традиционных химических процессов. Биокатализаторы получают из возобновляемых источников сырья, и после использования они легко разлагаются в окружающей среде. Как правило, применение биокатализаторов приводит к снижению выбросов и отходов (ионов металлов, различных солей, растворителей и др.).
Долгое время биокатализ рассматривался только как перспективное перспективное направление органического синтеза. Новая концепция органической химии, получившая название "Зеленая химия", кардинально изменила отношение химиков к биокатализу. Стало очевидно, что биокаталитические процессы полностью соответствуют принципам "зеленой химии". Это позволяет рассматривать биокатализ как экологически чистую альтернативу традиционным химическим технологиям.
Настоящий обзор посвящен анализу промышленно значимых процессов биотрансформации, используемых в реальном производстве, а также обсуждению перспектив развития биокатализа в органическом синтезе, в том числе и в России.
В химической промышленности существует два вида производства, различающихся по масштабам и видам продукции: крупномасштабное производство основного органического синтеза и мелкосерийное производство тонкого органического синтеза. К первому типу относится производство продуктов первичной переработки углеводородного сырья, которые характеризуются низкой скоростью и низкой ценой конечного продукта. Важнейшими продуктами основного органического синтеза являются синтетические углеводороды (этилбензол, толуол, стирол, бутадиен и др.), спирты и фенолы, альдегиды и кетоны, сложные эфиры, карбоновые кислоты, нитрилы и др.
В тонком органическом синтезе в качестве сырья используются продукты основного органического синтеза. Второй тип производства характеризуется многоступенчатостью, относительно высокими удельными энергозатратами и трудозатратами, часто обусловленными низкой производительностью на единицу объема реакторов, значительным количеством отходов, сложностью решения экологических вопросов и др. Важнейшими продуктами тонкого органического синтеза являются красители, лекарственные средства, текстильные вспомогательные и ароматические вещества, добавки к полимерным материалам, реагенты и др. Учитывая особенности двух типов процессов органического синтеза, становится ясно, что перспективы внедрения биокатализа в основной и тонкий органический синтез существенно различаются.
2. Промышленный биокатализ
Исторически биокатализ получил более широкое применение в фармацевтической промышленности, развиваясь в ответ на запросы фармацевтической промышленности об оптически активных изомерах. По данным Международного Строительного информационного общества (ICIS), рынок оптически активных молекул в 2002 году составлял 7 миллиардов долларов и в настоящее время растет на 10% ежегодно [1]. Этому способствовало решение регулирующих органов США и ЕС (Us Food and Drug Administration и European Committee for Proprietary Medicine Products), которое требует, чтобы физиологический эффект каждого энантиомера фармацевтического продукта характеризовался индивидуально.
Протеиногенные и небелковые аминокислоты. Большинство аминокислот, входящих в состав белков, вырабатываются сегодня микробной ферментацией сахаров. только две аминокислоты-l-аспарагиновая кислота и l-аланин-получают путем биотрансформации [2]. синтез l-аспарагиновой кислоты из фумаровой кислоты и аммиака осуществляется с помощью фермента аспартат-аммиачной лиазы (аспартазы). Биокатализатором, используемым в этом процессе, являются бактериальные клетки E. coli, иммобилизованные на полиазетидине [3]. 208-литровая колонна биокатализатора способна производить 1600 тонн аспарагиновой кислоты в год при круглосуточной работе в течение 330 дней

. Производительность такого биокатализатора превышает 220 000 г аспарагиновой кислоты на 1 г биокатализатора. Этот показатель в настоящее время является наивысшим достижением для ферментативных процессов.
Нативные небелковые аминокислоты, которые не могут быть получены ферментацией, получают в основном с помощью биокатализа. значительные перспективы здесь имеют трансаминазы [4]. Трудности использования этих ферментов для синтеза аминокислот связаны с обратимостью катализируемых ими реакций. Но эти трудности преодолеваются с помощью конъюгированных реакций.
Degussa (Германия) разработала универсальную платформу для получения различных L-и D-аминокислот и их производных из GI-дантоинов с использованием D - или L-гидантоиназ и D - или L-карбамоилаз [5]. Рацемическая смесь гидантоина является легкодоступным продуктом для традиционного химического синтеза. Сотрудники компании смогли преобразовать фермент D-гид-дантоиназу в L-гидантоиназу с помощью методов направленной эволюции и тем самым получили доступ к синтезу различных нативных L-аминокислот. система, состоящая из d-гидантоиназы и d-карбамоилазы, была использована для получения d-и-оксифенилглицина из гидантоина, который используется для производства полусинтетических антибиотиков.
Другой подход к разделению рацемических смесей основан на использовании ферментов l-ацилазы или амидазы, катализирующих энантиоселективный гидролиз. Дегусса использовал l-ацилазу для получения l-метионина, а dsm (Нидерланды) - стереоселективные амилазы, катализирующие гидролиз рацематов амидов аминокислот, полученных химическим путем из альдегидов.
Полусинтетические антибиотики. В настоящее время биокаталитические процессы являются основными в производстве полусинтетических антибиотиков. Проникновение биокатализа в эту область началось с получения соединений, содержащих бета-лактамные ядра: 6-аминопенициловой кислоты (6-АПК), затем 7-аминоцефалоспориновой кислоты (7-Аца) и 7 - амино-деацетоксицефалоспориновой кислоты (7-адкк). Получение 6-АПК из пенициллина G с помощью пенициллинацилазы является одним из первых примеров использования иммобилизованных ферментов в фармацевтической промышленности. В ферментативном процессе не использовались ранее требуемые органические растворители; исчезла необходимость в низкой температуре (-40°) и полностью безводной среде. 7-АСС получают из цефалоспорина с, продукта микробной ферментации, с использованием двух ферментов-D-аминокислотной оксидазы и глутариламидазы. Второй компонент для синтеза полусинтетических антибиотиков-D-и-оксифенилглицин-в настоящее время также получают путем биотрансформации гидантоина (см. недавно dsm объявила о разработке нового биокатализатора на основе пенициллинацилазы, который может быть использован для присоединения боковых цепей к бета - лактамному ядру[2]. Значительный вклад в создание такого биокатализатора внесли российские ученые [3].
таким образом, в настоящее время все стадии получения бета-лактамных полусинтетических антибиотиков основаны на биокаталитических процессах. Дальнейшее развитие в этой области связано с повышением производительности биокатализаторов и расширением их субстратной специфичности.
Оптически активные амины составляют важную группу соединений, которые используются в качестве хиральных блоков в фармацевтике и агрохимикатах. BASF (Германия) разработала ферментативный метод получения оптически чистых аминов, основанный на способности липазы избирательно ацилировать R-изомер амина в органической фазе. В результате одностадийного процесса можно получить^) - изомер с высокой оптической чистотой (>99%) [2]. Используя эту технологию, BASF начала производить S - метоксиизопропиламин (S-MOIPA), предшественник гербицида S-метолахлор, в 2002 году. Объем производства составлял около 2500 тонн в год. Дальнейшее развитие этих работ привело BASF к созданию платформы для получения широкого спектра оптических изомеров Аминов (платформа chipros). Основным недостатком этой технологии является высокий расход биокатализатора. В результате эта технология применима только для получения дорогостоящих соединений (свыше $ 10-15/кг).
Помимо аминов, платформа chipros также позволяет получать оптически активные изомеры спиртов и кислот (более 600 соединений) с использованием стереоселективных нитрилаз и дегидрогеназ. BASF выполняет заказы на производство оптических изомеров в количествах от нескольких граммов до тысяч тонн.
Альтернативный подход к синтезу хиральных аминов был разработан Целгеном. Он основан на использовании трансаминаз, которые способны превращать кетоны в амины. Полученные мутантные варианты трансаминаз были использованы для разработки высокоэффективного процесса получения S-MOIPA из метоксиацетона и изопропиламина. За 7 ч в водной среде можно получить до 180 г/л S-MOIPA, при этом конверсия метоксиацетона превышает 97%, а оптическая чистота составляет 99%. Основным недостатком описанного способа является необходимость использования в реакциях только водных растворов, что затрудняет работу с гидрофобными субстратами.
Сложные молекулы с множеством хиральных центров. В последние годы сформировалась новая ниша для применения биокатализа, связанная с синтезом сложных молекул с несколькими хиральными центрами. Как правило, это прекурсоры наркотических веществ, которые требуются в небольших количествах (от 1 до 100 кг) для тестирования. Потенциальные преимущества биокатализа для синтеза сложных молекул очевидны: ферменты обеспечивают высокую специфичность и стереоселективность синтеза; нет необходимости защищать активные группы. особенности разработки препарата требуют, чтобы метод синтеза позволял быстро получить необходимое количество опытных образцов для испытаний. однако разработка биокаталитического процесса требует значительного времени для того, чтобы найти или выбрать подходящий фермент. Решение заключается в создании библиотек изолированных ферментов, характеризующихся различной субстратной специфичностью. Такие библиотеки могут быть использованы для скрининга и выбора нужного фермента.
Для некоторых классов ферментов такие библиотеки уже созданы. Например, библиотека коммерчески доступных кеторедуктаз для получения хиральных спиртов содержит 80 ферментов. Эта библиотека позволяет работать с широким спектром субстратов, включая алифатические, ароматические кетоны, производные ацетона, кетоэфиры и т. д. создаются библиотеки других классов ферментов. Особый интерес представляют ферменты, осуществляющие прямой стереоселективный синтез необходимых молекул. Эти ферменты включают лиазы, еноатредуктазы, трансаминазы, монооксигеназы и нитрилазы (табл.3). Все эти ферменты позволяют получать оптически активные соединения из прохиральных субстратов (активированные олефины, альдегиды, кетоны, динитрилы).
Таким образом, библиотеки выделенных ферментов позволят быстро внедрить биокаталитические процессы на ранних стадиях разработки новых лекарственных препаратов.
Анализ промышленных биокаталитических процессов, применяемых в тонком органическом синтезе, позволяет сформулировать перечень требований к биокатализаторам: производительность (г продукта/г катализатора) должна быть не менее 1000 (при использовании очищенных ферментов) и не менее 15 (при использовании целых клеток); конечная концентрация продукта в реакционной среде — не менее 50 г/л и оптическая чистота — не менее 98% от нее [1]. Этот уровень требований является минимальным, необходимым для того, чтобы биокатализатор был востребован в реальном производстве.
3. Биокатализ в производстве лекарственных средств
Биокатализ - одна из перспективных отраслей биотехнологии, широко используемая в промышленности, сельском хозяйстве, тонком органическом синтезе, медицинской диагностике и экологической практике.
На сегодня вопрос биокатализа именно в производстве лекарственных средств является актуальным, которым занимаются как отечественные, так и зарубежные ученые.
Сейчас практически все активные фармацевтические ингредиенты синтезируются химическим способом и требуют много стадий химического превращения, что является энергозатратным, многостадийным и экономически неэффективным процессом. Для сокращения стадий производства и экономических издержек используют биокатализ, который является значительно выгодным и перспективным в фармацевтической промышленности