Апоптоз: механизмы, причины и регуляция

Введение
Жизнь любого многоклеточного организма сопровождается постоянным размножением клеток и их гибелью. Во время эмбрионального развития активное деление клеток, а также их миграция и дифференцировка лежат в основе образования тканей и органов. Однако даже в этот период некоторые клетки умирают естественным путем. Это способ регулирования размера клеточных колоний, формирования определенных частей растущего тела и установления контактов между различными типами клеток [8].
Существует два основных типа гибели клеток - некроз и запрограммированная гибель клеток. Некроз - неспецифический отек клеток и их мембранных органелл, который приводит к нарушению их целостности. Описано около 15 типов запрограммированной гибели клеток, самым распространенным и исследованным из которых является апоптоз [8]. Принципиальным отличием запрограммированной гибели клеток от некроза является то, что плазматическая мембрана сохраняет свою целостность, и клеточные остатки могут быть поглощены либо локальными макрофагами, либо соседними клетками. Общий ответ организма, такой как воспалительная реакция, отсутствует [8].
Несмотря на большое количество исследований в области молекулярных механизмов апоптоза, до конца остаются невыясненными аспекты связи между нарушениями апоптотических процессов и возникновениями большинства заболеваний, в том числе, онкологических [5]. Поэтому изучение механизмов и путей управления запрограммированной гибелью клеток является крайне актуальной задачей. Это позволило бы оптимизировать схемы химического и физического воздействия, применяемые при лечении рака и дегенеративных заболеваний [8].
Цель данной работы – изучить механизм апоптоза, пути его регуляции и биологическое значение.
Глава 1 Механизм апоптоза
Программа апоптотической гибели клеток состоит из следующих основных этапов:
- индукция или запуск апоптотической программы;
- активация проапоптотических белков;
- каскад каспаз (цистеинпротеаз) с последующим расщеплением белков-мишеней;
- деградация / реорганизация внутриклеточных органелл;
- фрагментация клеток в апоптотические тела;
- подготовка клеток и их фрагментов для фагоцитоза макрофагами или соседними клетками [8].
1.1 Пути инициации апоптоза
Инициация апоптоза происходит по нескольким основным путям:
1. Рецепторный (внешний) путь гибели клеток включается при связывании лигандов с мембранными рецепторами клетки и приводит к активации каспазы-8.
Известны два основных рецептора, принимающие сигналы к развитию апоптоза, – Fas (CD95) и рецептор для TNF типа 1 (TNFR1), а также дополнительные рецепторы CARI, DR3, DR4, DR5. Все перечисленные рецепторы являются трансмембранными белками, внеклеточный домен которых взаимодействует с соответствующим лигандом (Fas-лиганд (FasL) и лиганд TNF). Цитоплазматический домен рецепторов представляет собой последовательность из 80 аминокислотных остатков, называемую доменом смерти DD (death domain). «Домен смерти» передает внутрь клетки сигнал гибели [4, 5].
Активация рецепторов приводит к привлечению адапторных белков, включая TNF-рецептор-ассоциированный домен смерти (TRADD – TNF receptor-associated death domain) и Fas-ассоциированный домен смерти (FADD – Fas-associated death domain). Формирование комплекса лиганд-рецептор-адаптерный белок рассматривается как смерть-индуцирующий сигнальный комплекс (DISC-death-inducing signaling complex), который инициирует сборку и активацию прокаспазы-8, которая инициирует каскад эффекторных каспаз(рис.1) [6].
Рисунок 1 – Рецепторный (внешний) механизм запуска апоптоза [5]
2. Митохондриальный путь инициации апоптоза развивается при дефиците факторов, обеспечивающих выживаемость клеток (цитокинов и контактных сигналов от соседних клеток), а также под действием цитотоксических агентов (облучение, стероидные гормоны, цитостатики).
В результате изменяется баланс проапоптотических и противоапоптотических митохондриальных факторов семейства Вcl-2. Меняется проницаемость мембраны митохондрий, и в цитозоль выходит цитохром C. Он образует апоптосомный комплекс, состоящий из цитохрома-С, Apaf-1 (apoptotic protease activating factor 1) и каспазы-9 (рис.2). Комплекс активирует каспазу-3 (рис.3)[6, 7].
Рисунок 2 – Модель образования апоптосомы
Рисунок 3 – Митохондриальный механизм запуска апоптоза [6]
3. Внутренний путь, опосредованный эндоплазматическим ретикулумом. Начинается при дисгомеостазе ЭПР при гипоксии, активации свободнорадикального окисления, недостатке глюкозы, нарушении синтеза белка и других состояниях [6]. Путь, опосредованный эндоплазматическим ретикулумом, является у мышей каспаза-12-зависимым, у человека – каспаза-4-зависимым. Прокаспаза12 представляет собой резидентный белок ЭПР, ассоциированный с его мембраной со стороны цитозоля [8]. Активная каспаза12 отделяется от мембраны, поступает в цитозоль и вызывает протеолиз и активацию прокаспазы9, а каспаза9 активирует эффекторную каспазу3; причем этот путь осуществляется без участия Apaf1 и не требует выхода цитохрома С из митохондрий [8].
4

. Ядерный механизм апоптоза. Генерация внутриклеточных сигналов при данном механизме апоптоза прежде всего связана с белком р53, который экспрессируется при наличии поломок хромосом, разрывов ДНК и других генетических нарушений при действии различных факторов, особенно ионизирующей радиации. Фактор р53 участвует в экспрессии проапоптотических белков, таких как Bax, Puma, Noxa. Эти белки в свою очередь включают митохондриальный механизм апоптоза и соответствующий ему каскад каспаз [8].
1.2Эффекторная фаза. Каскад каспаз.
Следующий этап развития апоптоза является общим для указанных путей инициации. Эффекторная фаза заключается в запуске каспазного каскада.
Каспазы (цистеинзависимые, аспартатспецифичные пептидазы) - цистеиновые протеазы, которые распознают уникальную последовательность из 4 аминокислот в белковых субстратах и расщепляют их после остатка аспартата. В настоящее время описано 11 каспаз человека (каспазы-1-10 и каспаза-14); они делятся на воспалительные (каспазы-1,-4,-5) и апоптотические каспазы; последние подразделяются на инициаторные (каспазы-2,-8,-9,-10) и исполнительные (эффекторные) (каспазы-3,-6,-7) (рис.4) [8].
Каспазы находятся в цитоплазме практически всех клеток в неактивном состоянии в виде прокаспаз. При активации прокаспазы расщепляются на большую и малую субъединицы, которые затем собираются в тетрамерную структуру с двумя активными центрами [3].
Инициаторные каспазы активируют исполнительные каспазы-3,-6,-7, главной из которых является каспаза-3 [4, 5]. Откуда бы ни запускался каскад, его узловым звеном является каспаза-3. Завершающие члены каскада обозначаются как ICE (interleikin-converting enzymes) [3].
Рисунок 4 - Функциональные взаимодействия между инициирующими и эффекторнымикаспазами (каспаза-2 может существовать в форме двух изомеров,один из которых инициирует, а другой подавляет апоптоз).
Мишенями исполнительных каспаз служат многочисленные белки, которые локализуется в ядре и цитоплазме. Расщепление молекул-мишеней определяет весь спектр проявлений апоптоза.
Цитоплазматические мишени довольно многочисленны. Хорошо изучена роль фодрина (мишень каспаз), с которым связывают изменение клеточной поверхности в процессе апоптоза – появление выпячиваний и выступов [3].
К мишеням – ядерным белкам относятся гистон Н1, белок ламин В и белковый комплекс конденсин. С протеолизом этих белков связывают такие события апоптоза, как конденсация хроматина и фрагментация ядра [3]. Одна из главных мишеней каспазы-3 – эндонуклеаза CAD - осуществляет дегенерацию ДНК, воздействуя на доступные участки молекулы, расположенные между нуклеосомами.
Расщепление других мишеней каспаз обусловливает нарушения клеточного цикла, адгезии, клеточной морфологии и т.д. [4].
1.3 Морфологические изменения в клетке
Видимым показателем начальной стадии апоптоза можно считать уплотнение гиалоплазмы и образование различных цитоплазматических выпячиваний. При этом рибосомы объединяются в кристаллоидные структуры, а эндоплазматический ретикулум вакуолизируется [2].
Морфологическими признаками апоптоза служат конденсация хроматина и сжатие клетки. Во время раннего периода апоптоза методами световой микроскопии наблюдается пикноз: клетки меньше по размеру, цитоплазма плотная, органеллы плотнее упакованы. Пикноз является результатом конденсации хроматина. Гистологическое исследование с окраской гематоксилином и эозином показывает, что апоптотическая клетка имеет вид округлой или овальной массы с темной эозинофильной цитоплазмой и плотными пурпурными фрагментами ядерного хроматина. Целостность органелл все еще сохраняется, и все это заключено в неповрежденную плазматическую мембрану.
Далее клеточная мембрана формирует небольшие пузыри, и клетка начинает выталкивать свое содержимое внутрь везикул. В некоторые из них попадают части фрагментированного и конденсированного (пикнотического) ядра.
Финальная деструктивная стадия сопровождается распадом клетки на окаймленные плотные фрагменты – апоптотические тельца. Апоптотические тела состоят из цитоплазмы с плотно упакованными органеллами с ядерным фрагментом или без него [2, 4].
Эти тела впоследствии фагоцитируются макрофагами, паренхимными клетками или опухолевыми клетками и разлагаются внутри фаголизосом [4].
Глава 2 Причины и биологическая роль апоптоза
Впервые понятие апоптоза было выдвинуто в 1972 г. и обозначало “нормальную клеточную гибель при развитии тканей и их обновлении в зрелом организме”. Важно в этом определении то, что апоптоз является нормальным физиологическим процессом [5]. В отличие от некроза, воспалительная реакция при апоптозе отсутствует, поскольку цитоплазматические ферменты и токсические метаболиты остаются окруженными мембраной клетки (рис.5) [4].
Рисунок 5 – Сравнение механизмов некроза и апоптоза [3].
Причины апоптоза могут быть физиологическими и патологическими.
Физиологический апоптоз играет жизненно важную роль в процессе эмбрионального развития высших позвоночных, т.к